水稻转录因子基因SUSIRI的过表达及RNA干扰对水稻分子及表型效应的分析

在克隆到水稻转录因子基因SUSIRI的基础上,构建其过表达及RNA干扰载体进行水稻的遗传转化。由潮霉素筛选及分子检测得到的T0代植株经大田栽植,共有34株过表达及46株RNA干扰植株获得T1代转基因种子。继续种植T1植株收获T2代种子,同时用半定量RT-PCR分析苗期及穗期野生型水稻中SUSIRI基因的时空表达谱并比较过表达及RNA干扰植株的SUSIRI基因在叶片及幼穗中的表达状况,发现过表达植株与野生型对照的基因表达基本相同,但RNA干扰植株的表达受到明显抑制。对过表达及RNA干扰植株稻穗性状考察表明:与野生型对照相比,无论是过表达还是RNA干扰,转基因植株的穗粒数、结实率降低,RNA干扰植株表现得尤为严重(P<0.05),但对水稻谷粒粒重的影响并不显著(P>0.05)。SUSIRI基因的过表达未出现使稻穗性状明显改良的株系,而RNA干扰会导致水稻的结实能力严重降低。     

SUSIRI基因的生物信息学分析及亚细胞定位

转录因子是植物生长发育及其对外界环境的应答反应中起重要作用的蛋白调控因子,一般含有DNA结构域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。WRKY蛋白是一类具有重要作用的转录调控因子。在水稻的基因组中预测到的WRKY基因多达103个,对这些基因的功能加以注释具有重要的意义。SUSIRI基因是前人从粳稻日本晴中克隆的一个WRKY家族的转录因子。其开放阅读框长度为1755 bp,可编码584个氨基酸,具有典型的双WRKY结构域。为了进一步研究SSUSIRI基因,阐明它在水稻中的生物调控功能。通过应用生物信息学的方法,对该基因的预测蛋白进行了结构与功能的分析。利用EBI的interpro数据库分析SUSIRI基因序列的基序(motif),并结合NCBI的CDD(conserved domains)数据库分析该蛋白的保守结构域,用DNAMAN软件和CBS的TMHMM软件分析蛋白氨基酸残基的亲(疏)水性特点和跨膜结构域,用CBS的Protcomp version9.0软件和Protfun软件分别分析了蛋白的亚细胞定位和功能预测;通过实验设计把SUSIRI基因与GFP基因相融合,构建了由actin启动子驱动的SUSIRI基因的荧光表达载体p NSUGFP。通过采用基因枪法把该载体转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位鉴定。结果表明,生物信息学预测值显示:SUSIRI基因具有转录、转录调控、信号转导类功能的可能性最高,预测值分别为0.973、1.598和0.602;同时,其参与翻译功能、中间代谢功能和脂肪酸代谢功能的可能性也较大,预测值分别为4.800、1.490和1.265;由于SUSIRI蛋白中含有的亲水性氨基酸残基较多,该蛋白不具有跨膜性,是一种非跨膜类蛋白。对其亚细胞定位预测表明:在其氨基酸序列中含有较强的核定位信号,所以定位于细胞核内的可能性很大。进一步用荧光显微镜对基因枪轰击的洋葱表皮细胞的观察发现:对照的GFP蛋白主要沿细胞壁表达,而SUSIRI-GFP融合蛋白在细胞核中有很强的表达。通过试验研究得出:SUSIRI基因可能是一个参与中间代谢调控功能的基因,主要在基因转录环节发挥作用,是一种核定位蛋白。     

水稻中SUSIBA2相似基因RNA干扰体系的建立

大麦糖信号转录因子SUSIBA2是WRKY超基因家族的一员,通过识别某些淀粉合成酶基因启动子区的糖应答元件调控胚乳中淀粉的积累.本研究根据SUSIBA2序列,从水稻基因组中搜索到1个与SUSIBA2相似的基因,称为SUSIRI.利用PCR方法,从水稻基因组DNA中克隆出该基因第3外显子455 bp的片段,它包含1个WRKY保守结构域.以此作为干扰序列,构建了干扰载体.通过农杆菌介导法将其转化水稻,获得了16株T0代阳性植株.     

白藜芦醇合酶基因对草莓遗传转化的研究

根据已公布的白藜芦醇合酶基因（RS）序列，利用RT-PCR方法从川鄂爬山虎总RNA中获得完整的RS cDNA序列；根据已公布的草莓果实特异性启动子RJ39序列，利用PCR方法从草莓基因组DNA中获得该启动子序列；构建特异性植物表达载体pCAMBIA3300-RJ39-RS-Tnos；在根癌农杆菌介导下，利用叶盘法转化草莓，通过PPT筛选和PCR检测，获得18个转基因株系，对其中7个株系进行Southern印迹杂交鉴定，均杂交出条带。