我国甘薯E病毒全基因组序列特征及荧光定量检测技术的建立

【目的】甘薯E病毒(sweet potato virus E,SPVE)是甘薯上新发现的一种病毒。本研究对我国甘薯E病毒江苏徐州分离物(SPVE-XZ)的全基因组序列进行测定，分析该病毒基因组序列特征，并建立针对SPVE的荧光定量(quantitative PCR,qPCR)检测技术，为监测SPVE发生分布、检测种薯种苗中SPVE带毒情况并及时防控该病毒提供理论依据和技术支持。【方法】采用small RNA深度测序，结合RT-PCR和RACE技术，获得SPVE-XZ的全基因组序列，利用MegAlign、MEGA11等软件对获得的全基因组序列进行序列比对、系统发育关系分析。设计SPVE荧光定量检测引物，并通过对退火温度及引物浓度的优化，建立针对SPVE的qPCR检测方法，测定其特异性和灵敏度，应用于江苏省和山东省田间甘薯样品的检测。【结果】除ploy(A)外，所获得的SPVE-XZ全基因组序列全长为10 919 nt，包含1个长为10 560 nt的开放阅读框(open reading frame,ORF)，编码3 519 aa的多聚蛋白。5′非翻译区(5′untranslated re...     

玉米秸秆消化率全基因组关联分析

48h体外干物质消化率（48h in vitro dry matter digestibility, 48h IVDMD）是衡量青贮玉米品质的重要指标。为了初步探究玉米秸秆消化率的分子遗传机理,以341份玉米自交系为材料,于2018年在沈阳和通辽种植,收获后测定秸秆48h IVDMD。利用全基因组重测序获得的6 276 612个高质量SNPs进行全基因组关联分析,共检测到153个与玉米秸秆消化率显著相关的SNPs位点（P<1.0×10^-6）,4个SNPs显著水平在P<1.0×10^-8以上;共找到38个秸秆消化率的候选基因,主要涉及细胞生长发育、防御反应和信号转导等生物学功能。     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^? RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（C.limon）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

中国樱桃InDel标记开发及其在蔷薇科果树中通用性评价

对栽培和野生中国樱桃进行De novo基因组测序和比对，在全基因组范围内检测筛选出50 617个InDel位点，并挑选均匀分布的200个标记进行验证，其中，27个标记在中国樱桃种内表现出多态性。利用多态性标记，对不同来源的192份中国樱桃（168份栽培和24份野生）种质进行基因型分型，共检测到60个等位基因（N_a），平均每个标记2.2个；基因多样性指数（H_s）为0.010 ~ 0.500，平均0.239；多态性信息含量（PIC）为0.010 ~ 0.375，平均0.198，表明中国樱桃遗传基础相对狭窄。根据聚类结果和地理分布将192份中国樱桃种质大致划分为5个群体。筛选出在蔷薇科李亚科樱属、李属、桃属、杏属、苹果亚科梨属、苹果属和蔷薇亚科草莓属、悬钩子属等重要果树共8个属156个个体中表现出较好通用性标记34个。物种与中国樱桃亲缘关系越近，InDel标记的多态性越高。     

基于叶绿体DNA分析的楸子种质遗传多样性研究

利用4对叶绿体DNA引物扩增49份楸子[Malus prunifolia（Willd.）Borkh.]种质资源的4个叶绿体DNA基因间区trnH-psbA、trnS-trnG spacer + intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF序列，基于4个叶绿体DNA基因间区的序列变异，从母系遗传的角度评价楸子的遗传多样性水平。结果显示：4个叶绿体DNA基因间区序列经测序、拼接、比对和合并之后的片段长度为3 790 bp，共有173个多态性变异位点，其中包含2个单一突变位点、20个简约信息位点和151个插入/缺失位点。在49份楸子种质中，trnH-psbA、trnS-trnG spacer + intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF区域的变异位点的数量分别为26个、25个、120个和2个，单倍型数量分别为9个、7个、8个和3个，合并之后的叶绿体DNA片段的单倍型有14个。核苷酸多样性和单倍型多样性最高的区域均为trnH-psbA（Hd = 0.775，Pi = 0.02143），最低的为5′trnL-trnF（Hd = 0.481，Pi = 0.00072）。49份楸子种质4个叶绿体DNA区域合并后的遗传多样性较高（Hd = 0.854，Pi = 0.00949）。Tajima’s D检验中，4个叶绿体DNA区域在P > 0.10水平上均不显著，楸子的4个叶绿体DNA区域在进化上遵循中性进化模型。楸子的遗传变异主要存在于群体内部，不同居群间基因交流频繁，多数居群间遗传分化较少，与地理距离不完全相关。     

大花君子兰叶绿体基因组及其特征

采用Illumina MiSeq测序平台对大花君子兰（Clivia miniata）叶片总DNA进行测序，通过组装获得了其叶绿体基因组（cpDNA）全长序列（158 114 bp）。对其cpDNA注释得到135个基因，包含87个蛋白编码基因、40个tRNA基因和8个rRNA基因。采用生物信息学方法对获得的cpDNA进行简单序列重复（SSR）分析和密码子偏好性分析。结果显示：①大花君子兰cpDNA中共有61个SSR位点，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复数分别为38、9、2、8、3和1个，多数SSR分布在基因间隔区；②大花君子兰cpDNA密码子偏爱以A或U（T）结尾，亮氨酸使用频率最高，半胱氨酸使用频率最低。基于24种植物的cpDNA全长和23种植物的叶绿体ycf2基因序列进行系统发育分析，结果显示大花君子兰与石蒜科植物在同一分支，显示最近的亲缘关系，支持大花君子兰属于石蒜科。基于叶绿体ycf2的系统发育分析结果与基于cpDNA全长的系统发育分析研究结果大部分相同，支持ycf2基因可以代替cpDNA全长用于植物系统发育分析。     

胡葱黄条病毒吉林毛葱分离物全基因组序列测定与分析

使用RT-PCR方法从吉林省疑似感染胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus,SYSV)的分蘖洋葱(毛葱)叶片中获得了SYSV吉林毛葱分离物SYSV-JL(MN607702)的全基因组序列。SYSV-JL的全长序列为10?427 nt,与GenBank已登录的3条SYSV全长或近全长序列在多个基因上保持着较高的序列一致性,但在P1基因上核苷酸和氨基酸序列一致性较低,分别为69.5%～84.2%和60.9%～76.9%,进一步通过变异分析发现,P1基因包含369个变异位点,表现出较为明显的高变异特征。系统发育分析显示,不同SYSV分离物具有较为明显的地区差异,SYSV-JL分离物与多个中国分离物系统发育关系较近。     

牦牛瘤胃微生物抗生素抗性基因对3种外源性刺激因子的响应

通过给牦牛投喂硫酸头孢喹肟(CEF)、盐酸二氟沙星(DIF)和黄曲霉毒素B1(AFB1),并进行瘤胃微生物宏基因组测序,旨在揭示这3种外源性刺激因子对抗生素抗性基因(ARGs)种类、抗性类型、抗性机制等的影响,对于深入研究微生物抗性组特征和抗性机制具有重要价值。选取15头牦牛,随机分5组。Cef组和Dif组分别根据说明书推荐剂量按体重计算、灌服CEF 1 mg·kg^-1和DIF 1 mL·kg^-1;E1组和E2组分别按采食量投喂AFB120、60μg·kg^-1;C组为对照组。处理7 d后,采集瘤胃液,提取DNA,Illumina HiSeq测序,对reads counts进行标准化得到TPM值,并进行方差分析。结果显示,对照组共获得132种ARGs,分属30种抗性类型,其中,四环素类tetQ和tetW基因丰度较高;Cef组tetW基因丰度增加(P<0.05),Dif组tetQ丰度增加(P<0.05);Cef组四环素类和头孢菌素类抗性基因丰度增加(P<0.05),Dif组四环素类和氨基香豆素类抗性基因丰度增加(P<0.05),E1组氨基香豆素和青霉烯类抗性基因丰度增加(P<0.05),E2组青霉烯类、头孢菌素类等9类抗性基因丰度均增多(P<0.05);Dif组Erm基因23S核糖体RNA甲基转移酶丰度增加(P<0.05),E2组中ATP结合盒超家族等3种抗性机制相关基因的丰度增加(P<0.05);3种因子均显著增加四环素类ARGs宿主的种类。结论:瘤胃是蕴含丰富ARGs的储藏库,其中,四环素类抗生素抗性基因tetQ和tetW是主要的ARGs。不仅CEF和DIF使部分ARGs的种类、抗性类型以及耐药机制相关酶等的丰度升高,增加瘤胃微生物的耐药性,而且AFB1也具有类似作用,且高剂量AFB1对抗性类型的影响范围较抗生素大。这3种因子还导致携带四环素类ARGs宿主微生物的种类数量增加,从而强化横向转移机制,加快ARGs传播,增强微生物对四环素类的耐药性。     

全基因组关联分析阈值的快速算法

逐个SNP的全基因组关联分析中的统计量不仅依赖于遗传效应,而且依赖于SNP,因此统计量不能直接应用于推断无遗传效应的零假设中。检测不同样本的QTN,常用的统计量除了卡方统计量,还有t统计量、F统计量和标准正态统计量。首先给出了各个统计量之间的关系,接下来针对冗余参数背景下的全基因组关联分析,提出了检验统计量阈值的快速计算方法。再次利用获得的高通量SNP的统计概率构建卡方统计量,进而估计临界值。最后模拟不同样本的阈值并与文献上提出的阈值算法比较。大量模拟实验证明,提出的方法快速而且有效。     

猕猴桃溃疡病菌biovar 3群体MLVA分型技术的建立与应用

 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种生物型3(Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar 3,Psa3)是猕猴桃溃疡病菌的世界流行群体,但仅在中国存在复杂的遗传多样性。开发适于Psa3群体分型的MLVA(multilocus variable-number tandem-repeat analysis)技术是探索中国Psa3起源与流行学特性的基础。本研究对7个Psa3菌株进行了全基因组测序,结合已公布的86个全基因组数据,进行比较分析发现,中国Psa3至少存在7个亚群;在各亚群间存在多态性的24个串联重复序列中,其中10个可以通过琼脂糖凝胶电泳区分开且变异指数合适,据此建立了适于Psa3的MLVA技术。采用该技术对分别来自贵州和陕西的62和9个Psa3菌株进行群体分型,分型结果与全基因组分析高度一致,证明该MLVA体系分型准确。MLVA分型结果表明:贵州主产区修文县Psa3有3个MLVA群体,其中亚群4的组内分化明显,代表最早发生的群体;而亚群 1和3的结构单一,且多在新果园发现,是新传入群体。总之,本研究建立了一套可用于Psa3群体分型的MLVA技术,将有助于解析中国各猕猴桃产区Psa3群体结构,以及探索中国Psa3的起源、传播和流行学特征。