一种适于PCR和LAMP检测的松木中松材线虫DNA快速提取方法

【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫 DNA 的方法。【方法】运用 Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫 DNA 的方法,并通过普通 PCR 与环介导等温扩增( LAMP)对提取的 DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫 DNA 的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%( W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的 CTAB法和蛋白酶 K 法比较,Chelex-100法提取的 DNA得率高,相同条件下,该方法提取的 DNA浓度远远大于常规方法。3种方法的 OD260/280比值从大到小依次为CTAB法＞蛋白酶K法≥Chelex-100法,Chelex-100法的OD260/280值显著低于CTAB法,而略低于或等同于蛋白酶K法,但这并不影响对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。采用 Chelex-100法提取松木中松材线虫的 DNA,结合常规的PCR和 LAMP检测,检测灵敏度高,特异性强,稳定性好;提取的松材线虫 DNA 的75倍稀释液再稀释32倍后进行PCR扩增,扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的 DNA 后进行检测,所有带病松木样品的检测结果均呈阳性,而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外,该提取方法简便快速,20 min内即可完成整个 DNA的提取;经济方便,试剂保藏无特殊要求,单个样品提取耗费低于3.5元。【结论】Chelex-100法是一种快速有效的提取松木中松材线虫DNA的方法,此方法结合PCR和LAMP检测技术将进一步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性,可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。     

淡紫拟青霉不同菌株对南方根结线虫卵寄生率三种处理方法的比较

利用来自不同地域的淡紫拟青霉的13个菌株，分别用其孢子液处理南方根结线虫分散卵粒、菌丝处理分散卵粒、孢子液处理卵囊以评价淡紫拟青霉对南方根结线虫的寄生性。在被试所有菌株中，同一菌株三种不同方法对根结线虫卵的寄生率相比，孢子液处理卵囊均明显高于其他两种处理。不同菌株对南方根结线虫卵的寄生率有很大的差异。三种处理方法结果显示618号菌株寄生率均为最高。菌株对卵的寄生率与菌株地理来源无明显相关性。     

厚壁轮枝菌摇瓶液体发酵培养的研究

厚壁轮枝菌对根结线虫虫卵有很强的寄生力,是线虫的生防菌,本文对其最适培养条件进行了研究.每12 h对其产孢情况进行跟踪,探讨了不同C、N源,初始pH值,无机盐对其产孢量的影响,确定了适宜的培养条件及发酵终止时间.结果显示,28 ℃下,在160 r·min-1 摇床上,以500 mL三角瓶200 mL的装量进行液体培养,筛选出的最佳复合培养基配方为:葡萄糖20 g·L-1,玉米粉20 g·L-1, 黄豆粉20 g·L-1,KH2PO4 0.5 g·L-1 ,MgSO4·7 H2O 0.5 g·L-1.最佳pH值范围5.0～7.0,最适发酵终止时间120～144 h.     

泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗血清的制备及应用

 根据报道的泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’-broom phytoplasma,PaWB)抗原膜蛋白(antigenic membrane pro-tein,AMP)基因的核苷酸序列设计引物,提取发病泡桐总DNA,经PCR扩增并成功克隆泡桐丛枝植原体amp基因。序列分析表明,amp基因由696个核苷酸组成,编码231个氨基酸残基,与GenBank中登录的2个泡桐丛枝植原体的膜蛋白核苷酸序列同源性为100%。将amp基因91-604 nt部分序列(命名为ampd)克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,诱导后,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表明融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以纯化的带GST标签的AMPD融合蛋白为抗原免疫德国大白兔,制备了PaWB-AMPD抗血清。利用该血清,通过Western印迹、点印迹、ELISA、间接免疫荧光和免疫捕获PCR试验均能在发病泡桐组织中特异检测到泡桐丛枝植原体。     

我国木本植物根癌病检疫与防治问题思考

根癌病也称冠瘿病,是由土壤杆菌引起、危害多种木本植物的严重的细菌性病害,在世界许多国家都有发生。我国分布普遍、危害严重。根癌病已成为世界上最主要的植物细菌性病害之一。着重介绍了该病害的原理、命名、分布、寄主范围、危害和病原鉴定、检测技术进展,围绕病害检疫和防控问题,提出了相应的解决对策和建议。     

山东蚕区桑黄化型萎缩病病原物的分子鉴定

以采自山东省宁阳市桑园的桑黄化型萎缩病发病植株叶脉组织为材料,通过PCR扩增植原体16S rRNA基因及延伸因子基因(tuf)和核糖体蛋白基因(rp),分别得到大小约为1.4、0.8和1.2 kb的目的片段并测定序列。以该病原物的16S rRNA基因与GanBank中相关的植原体16S rRNA基因序列构建系统发育树并进行RFLP分析,结果显示该病原物属于翠菊黄化组的16SⅠr-B亚组,与翠菊黄化组16SⅠr-B亚组典型成员的同源性为99.9%。进一步对延伸因子基因和核糖体蛋白基因构建系统发育树并做RFLP分析,结果显示该病原物与翠菊黄化组的tuⅠf-B亚组典型成员和rpⅠ-B亚组典型成员的同源性分别达到99.6%、99.9%。由此在3个基因水平确定该植原体的分类地位属于16SrⅠ-B、tuⅠf-B和rpⅠ-B亚组。     

我国城乡泡桐丛枝病区域差异因子分析

为了解析与揭示我国泡桐丛枝病发生区域扩散和流行规律, 科学制定病害防治策略与对策, 分别于2018年至2020年在我国4大泡桐分布区内选取37个代表性城市与乡镇调查点, 对泡桐丛枝病发病率和病情指数?泡桐种类与栽植生境等进行了调查; 采集休眠病枝于室内水培萌芽和外植体组织培养, 并提取泡桐总DNA采用PCR与LAMP方法检测植原体?研究结果表明, 我国4大泡桐分布区中黄淮海暖温区和西北干旱区是该病害发生的重病区, 而西南亚湿热区次之, 江南温暖湿润区受害最轻?多数情况下, 同一地区的城区与乡镇的总体发病率和危害程度存在一致性; 在一些泡桐人工林主栽区与传统重病区呈现出中幼林发病率和病情指数明显降低的趋势?相关分析和回归分析结果表明, 泡桐丛枝病病情指数与年均温度和年均降水量呈负相关关系?除来自陕西省西安市楸叶泡桐组培苗发病率和病情指数相对较低外, 其他不同泡桐种类和地区来源染病外植体的组培苗发病率和病情指数分别达93.3%~100%和52.1~76.9, 泡桐休眠病枝萌芽的植原体综合检出率为76.5%?因此认为我国泡桐丛枝病发生与危害的南轻北重差异受气候?寄主抗性以及种苗带菌等因子的影响; 研究结果将为针对不同生境的泡桐丛枝病制定综合防控策略与科学决策提供理论依据?     

泡桐脱毒组培和规模化生产关键技术改进

对获得的C020、MB33、ZL-3、C125、YG、T1、9501、MG等泡桐不同品系组培苗,采用热处理结合茎尖培养和病菌检测,获得了其脱除泡桐丛枝植原体的脱毒组培苗.确定了适宜于不同品系的增殖培养条件和生根组培苗移栽至营养杯的基质.在中原地区,利用普通温棚春季营养杯苗移栽适宜时间为3月中旬至5月初,秋季移栽时间为8月下旬至10月上旬.春季生产的营养杯苗当季栽植因木质化程度低需带钵运输和苗圃定植,而秋季生产的根系木质化程度高的自然落叶休眠的营养杯苗能够在低温下安全越冬,次年早春可以裸根运输和栽植.这种营养杯苗的秋季生产方式不仅能提高造林成活率和当年生长量,而且能大大降低运输成本.     

黄龙山林区鸟类资源及保护利用

地处陕北黄土高原东南部的黄龙山次生林区，沟壑纵横，连绵不断，森林植被覆盖率较高，为野生动物提供了良好的栖息环境。本文对黄龙山林区鸟类动物的区系、种类、分布以及保护与利用进行了研究，以便唤醒人们的保护意识，正确引导对这些自然资源的合理利用。     

睡眠嗜血杆菌复合体病研究进展

Haemophilus somnus has long been associated with thrombotic meningoencephalomyelitis but has also been identified as the agent responsible for other clinical diseases including respiratory disease, reproductive problems, myocarditis, otitis, conjunctivitis, mastitis, and polyarthritis. Exposure to the bacteria is widespread and infection may occur via the respiratory tract from urogenital excretions and secretions.Diagnosis and treatment of hemophilosis may be easy or difficult depending on the manifestation presented, and special procedures must be taken to facilitate isolation of the organism. vaccination is the only preventive measure demonstrating a beneficial effect.