PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM F92株qPCR区分方法的建立与应用

 
为快速准确区分PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM F92株以及对流行毒株进行定量检测,按GenBank中发表的美洲型PRRSV SX 1分离株、弱毒疫苗株NSP2基因缺失部位的不同设计了一对特异性引物,通过RT PCR和体外转录的方法,构建了体外转录RNA作为标准品,并对反应条件和反应体系进行优化,旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性和稳定性良好的qPCR鉴别方法。结果表明,该方法最低能检测出1.0×101拷贝/μL的模板,敏感性比常规PCR高100倍;应用该方法对218份临床样本进行鉴别与定量,qPCR检出率较常规RT PCR高12.9个百分点。研究表明,qPCR鉴别方法的建立实现了对PRRS流行毒株与疫苗毒株的快速区分以及对流行毒株的定量检测,为PRRS的快速诊断提供了依据。     

荷花腐败病菌的荧光定量PCR检测

建立一种快速、特异性强的定量检测荷花腐败病菌(Fusarium commune)的技术,评估该技术用于荷花腐败病菌定量检测的可行性,并对东莞莲湖的土壤、莲藕等样品的荷花腐败病菌数量进行动态监测,为防治该病害提供依据。采用以SYBR Green I为荧光染料的实时荧光定量PCR(qPCR)技术,对不同发病级别的荷花植株及其地下土壤的荷花腐败病菌的含量进行检测,并分析病菌含量与病害级别的相关性。结果表明,利用qPCR技术检测的最低检测限为1 fg/µL,添加健康荷花组织的基因组DNA后,该qPCR技术的最低检测限为10 pg/µL。对该qPCR反应的溶解曲线进行分析,扩增的产物仅有1个峰值,表明采用该qPCR技术扩增的DNA产物具有高度的特异性。染病植株中荷花腐败病菌的DNA含量与其发病程度呈正相关,而莲湖土壤荷花腐败病菌含量与病害级别的相关性低,但土壤中荷花腐败病菌的数量随着病害级别提高而增大。该qPCR检测体系能够对莲湖的土壤、发病莲藕等进行荷花腐败病菌的动态监测,可为该病的有效防治提供依据。     

木薯蔗糖转运蛋白基因的表达分析

以木薯SC124为材料,分别在植株发育8个时间点取其块根和功能叶,利用实时定量PCR技术（qPCR）对木薯SUT1、SUT2、SUT4三类蔗糖转运蛋白基因表达差异进行研究。结果表明,在木薯块根形成期（90 d）3类SUT表达的日变化中,功能叶和块根中均以中午12 h最高,其余时间较低,叶片中SUT1和SUT2表达水平较高而块根中差异不显著;在整个发育过程中,叶片表达水平高于块根,且二者均为前期表达水平高,后期下降,3个SUT之间的表达量也有着明显的差异,叶片中SUT1的表达量最高,其次是SUT2,SUT4最低,在块根中除60 d时SUT1的表达量较高外,其它SUT表达量均较低,SUT4在叶片和块根中的表达量差异不大。     

合浦珠母贝实时定量PCR内参基因的稳定性比较

以合浦珠母贝（Pinctada fucata）为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）和18S核糖体rRNA（18S rRNA）3个管家基因在合浦珠母贝不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期mRNA水平的表达情况。同时比较了BestKeeper、geNorm和NormFinde软件对试验数据处理的差异,从中选出合适的内参基因。结果表明β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定,18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。     

紫云英2个转脂蛋白基因在共生及重金属镉胁迫条件下的表达特征

采用实时荧光定量PCR技术,研究了紫云英共生表达的非特异性转脂蛋白编码基冈AsE246和AsJB259在根瘤发育和固氮过程中的组织和时空表达特征,并初步考察了其在重金属镉胁迫条件下表达水平的变化.结果表明:2个目标基因仪在紫云英根瘤中特异表达,并且均在接种华癸中慢生根瘤菌7653R后22 d左右表达量达到最高.在低浓度...     

稻瘟病菌孢子qPCR方法的建立及用于监测气传菌源的研究

稻瘟病是水稻生产中最具毁灭性的真菌病害之一,监测田间空气中稻瘟病菌分生孢子数量动态变化,对于预测病情发生和指导及时防治具有重要意义。该研究以稻瘟病菌MHP1基因为靶序列,建立了1种稻瘟病菌分生孢子qPCR定量方法,并采用此方法对田间气传稻瘟病菌源进行了监测。监测数据显示,监测期间空气中稻瘟病菌分生孢子数量波动幅度较大。结合气象条件进行分析,菌源量的波动与气象条件相关。该研究建立的孢子qPCR方法可应用于监测气传稻瘟病菌源。     

几个常用内参基因在淀粉酶产色链霉菌1628抗药性突变株中稳定性的评估

淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是一株重要的生防菌株,其代谢产物对多种植物病原真菌具有较强的抑制效果。为了筛选在其不同抗药性高产突变株中均能稳定表达的内参基因,选择16S rRNA、sigB、hrdB、thyA、gyrB和rpoA共6个常见内参基因,分别探究它们在野生型菌株、链霉素抗性突变株、利福平抗性突变株和巴龙霉素抗性突变株中的表达情况,并用geNorm软件和NormFinder软件对结果进行分析。结果表明,使用不同软件分析得出的最佳内参基因略有差异。geNorm软件认为在上述4株菌株中,表达最稳定的内参基因分别是gyrB、gyrB、thyA、rpoA;而NormFinder软件认为rpoA基因在所有菌株的表达都是最稳定的。利用平均等级的算法平衡两个软件的分析差异,最终确定rpoA基因为表达最稳定的内参基因。通过检测toyG基因的表达水平,发现以rpoA作为内参基因能得到更合理的结果。     

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。