玉米规模化转基因技术体系构建及其应用

玉米是世界种植范围最广、产量最高的粮食作物,为保证世界粮食安全做出了重要贡献。但是病虫害、杂草、干旱、盐碱等生物或非生物胁迫严重影响了玉米生产。培育具有抗虫、抗除草剂、抗病等性状的转基因玉米品种并应用到实际生产中,能够减少玉米产量损失,减少农药化肥使用量。玉米规模化转基因技术体系研究发展迅速,获得的抗虫、抗除草剂转基因玉米已在国外商业化种植18年,带来巨大的经济、社会和生态效益。全球转基因作物种植面积从1996年的170万公顷增加到2013年的1.75亿公顷。转基因玉米新品种培育需要较成熟的玉米规模化转基因技术体系。目前,商业化种植的转基因玉米都是从大量转基因玉米中选择的,具有外源基因单拷贝插入、遗传稳定、无载体骨架插入、目的基因表达合适、对玉米自身性状无影响等特点。国外大公司及部分公立研究机构建立了相对成熟的玉米转基因技术体系。中国玉米转基因技术体系研究起步较晚,目前初步建立了玉米规模化转基因技术体系,有必要进一步提高玉米遗传转化效率及规模化程度。玉米规模化转基因技术体系采用的主要方法是基因枪法和农杆菌介导法。文章详细介绍了2种方法的原理、发展过程及其应用。农杆菌介导法是目前最主流的植物遗传转化方法,具有成本低、外源基因拷贝数低、外源基因能稳定遗传表达等特点,更适用于规模化转基因技术体系。中国在玉米转基因技术体系研究及应用方面有很好的进展,在转基因受体材料选择、农杆菌侵染方法优化等方面对农杆菌介导的玉米遗传转化方法进行了系统优化,以国际上常用的玉米杂交种HiII及中国玉米优良自交系综31等为转化受体,建立了基于幼胚的玉米规模化转基因技术体系,并很好地应用于转基因玉米新品种的创制,获得大量具有生产应用价值的抗虫、抗除草剂转基因玉米。文章展望了玉米转基因技术体系的发展趋势,认为商业自交系作为外植体的筛选、转化事件单拷贝率的提高、无载体骨架序列转基因的提升、多基因转化技术、基因打靶技术、基因编辑技术及安全转化技术等方面是玉米转基因技术发展的趋势。中国应紧跟玉米转基因技术发展趋势,大力发展多基因转化技术、基因打靶技术及安全转化技术,使转基因玉米技术体系更好地服务于基因功能研究、转基因玉米产品研发等。中国通过玉米规模化转基因技术体系获得的转基因玉米将来进入产业化应用,将带来巨大的经济效益、社会效益和环境效益,并将推动玉米转基因技术体系的进一步发展。文章为玉米转基因技术体系优化和转基因玉米新材料获得等方面的研究提供一定的参考。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

特异玉米种质四路糯的穗行数遗传解析

【目的】玉米穗行数与产量密切相关,剖析其遗传基础对指导玉米育种实践具有重要意义。【方法】以只有4行籽粒的中国特异地方品种四路糯选系和多穗行数的自交系农531为亲本,采取单粒传法（single seed descend method, SSD）构建正反交F2:3分离群体。在北京昌平和河南新乡采用随机区组试验设计进行分离群体家系的穗行数表型鉴定。与此同时,根据玉米基因组数据库上公布的标记信息,在全基因组范围内筛选获得173个具有多态性的SSR标记,用于群体基因型鉴定及遗传图谱构建。采用完备区间作图法（ICIM）和复合区间作图法（CIM）进行玉米穗行数QTL定位和遗传效应分析,利用SAS软件GLM程序估计主效QTL对分离群体穗行数遗传变异的贡献率。【结果】表型鉴定结果表明,亲本四路糯选系与农531的穗行数平均值分别为4.0行与19.2行,F2:3家系穗行数变化范围为4.0-17.4行。利用完备区间作图法,分别对北京昌平、河南新乡的正交F2:3群体进行穗行数QTL定位,2个环境下共检测到12个穗行数QTL,分布于除第1、7染色体外的其他8条染色体上。等位变异来源分析表明,本研究定位的QTL减效等位变异全部来自少穗行数亲本四路糯选系。共有5个主效QTL在2个环境下均被检测到,其中,位于bin2.04区间内的主效位点qKRN2-1在单环境下最大可解释群体穗行数变异的18.48%,其余4个主效位点及其单环境下解释的最大表型变异分别为qKRN4-2（11.58%）、qKRN5-1(13.55%)、qKRN8-2（16.91%）和qKRN9-1(9.66%)。利用复合区间作图法,在联合环境条件下共检测到5个穗行数QTL,分布在第2、4、5、8、9染色体上,每个QTL解释的表型变异范围为6.13%-10.05%,除位于第5染色体的QTL以外,其余4个位点与完备区间作图法定位到的主效QTL区间一致。一般线性模型分析显示,在2个环境下,5个主效QTL可分别解释正交F2:3群体51.5%（北京昌平）和54.0%（河南新乡）的表型变异。还定位到2对穗行数上位性QTL位点,分布于第2,、4、9染色体上,但表型贡献率分别仅为2.90%和1.80%。【结论】穗行数减效等位变异全部来自四路糯选系,鉴定出5个玉米穗行数主效QTL,分别位于bin2.04、bin4.09、bin5.04、bin8.05和bin9.03。表明该四路糯选系可作为重要的穗行数遗传研究材料,而定位到的主效QTL可作为玉米穗行数候选基因图位克隆和玉米遗传基础研究的重要候选区段。     

用锚定PCR技术筛选谷子微卫星文库的研究

本试验将锚定PCR技术用于谷子微卫星富集文库的筛选,结果发现该技术能有效减少假阳性的产生,假阳性率仅为7.7%,该技术还能够最大限度淘汰侧翼无法设计引物的无效微卫星克隆,本研究无效克隆比率仅为3.8%.用锚定PCR技术最终筛选开发出13对多态性微卫星标记,这些标记在4个谷子材料和1个野生种中扩增出等位变异数为2～4.锚定FCR技术与常用的同位素杂交筛选技术及普通PCR技术相比,更能降低假阳性克隆和无效微卫星克隆的产生,是一种理想的微卫星文库筛选技术.     

玉米蔗糖转运蛋白基因ZmERD6 cDNAs 的克隆与逆境条件下的表达

在前期的研究中发现一个玉米苗期早期应答干旱的EST序列,与拟南芥ERD6序列同源性较高。本研究应用电子克隆与同源克隆技术分离出这个基因,并命名为ZmERD6。研究表明ZmERD6具有大小两个转录本,分别被命名为ZmERD6-L和ZmERD6-S。ZmERD6-L开放阅读框1 515 bp,编码505个氨基酸,ZmERD6-S开放阅读框1 386 bp,编码463个氨基酸。序列分析表明,ZmERD6-L和ZmERD6-S蛋白结构中含有两个MFS (major facilitator super-family)结构域,属于MFS家族的蔗糖转运子(sugar transporter)亚族。跨膜结构预测表明两个蛋白都具有多个跨膜区,ZmERD6-L蛋白含12个而ZmERD6-S含11个跨膜区。利用半定量RT-PCR分析ZmERD6在ABA、干旱、盐和冷胁迫处理以及不同组织中的表达情况,表明ZmERD6基因在不同胁迫下能被诱导表达,在不同组织中表达有差异。通过在玉米基因组数据库中的查询和比对获得ZmERD6基因上游2.5 kb的序列,生物信息学预测表明该序列具有启动子的核心序列及上游增强子序列、抑制子序列,同时还具有冷、茉莉酸甲酯等激素调控序列。     

两个历史上重要的玉米地方品种群体的表型多样性评价

以20世纪我国玉米生产上应用的两个地方品种群体白马牙和金皇后为研究对象,以国家种质资源信息系统(CGRIS)中收录的这两个群体的14个性状观测值为分析依据,对这两个群体进行了表型多样性评价和类群结构研究。结果表明：我国玉米地方品种核心种质库中收录的白马牙的种质份数明显多于金皇后,在地理分布上也明显比金皇后广泛;两个群体内的材料在穗粒性状上都具有相似的特性,但两个群体也表现出了较大的差异,其中白马牙主要以白色偏硬粒型子粒为主,而金皇后则以黄色偏马齿型子粒为主;UPGMA聚类分析结果显示,白马牙群体内的材料分组与玉米生态区有对应关系。     

玉米V-ATPase B亚基基因(ZmVHA-B)的克隆及其表达分析

根据玉米基因组数据MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)已经公布的玉米VHA-B(V-ATPase subunit B)基因的mRNA序列(AY104180),从干旱处理玉米材料CN165的花丝中利用RT-PCR技术获得VHA-B基因的编码序列,并进行了序列分析和Northern杂交分析。结果表明：VHA-B基因编码487个氨基酸,含有1个保守的ATP结合位点,其编码的蛋白分子量为54.09 kD,等电点为4.99。氨基酸同源性分析表明：V-ATPase B亚基是一个较为保守的蛋白亚基。Northern杂交结果表明：在干旱处理下,B亚基存在两个不同的转录本,它们对干旱的响应不同;在盐胁迫下,同样也存在两个转录本,它们都对盐胁迫做出了响应;在冷处理下,仅存在1个转录本,且它的表达较强,仅仅在6 h有一些微小地反复;在ABA处理下,也仅存在1个转录本,处理1 h后表达明显上调,此后一直保持较高的表达水平。玉米VHA-B基因对花期干旱有响应,但在花丝和雌穗中的表达响应方式不同,在花丝中干旱诱导表达明显,而在雌穗中存在表达没有明显差异的两个转录本。     

中国玉米骨干亲本黄早四杂种优势形成的遗传基础解析

【目的】杂种优势利用是实现玉米高产育种的重要途径。解析玉米骨干亲本黄早四杂种优势形成的遗传基础,对指导中国玉米骨干亲本高效利用和高产育种具有重要的理论研究意义与生产利用价值。【方法】以玉米黄改系杂种优势类群的骨干亲本黄早四为共同亲本与11个代表性自交系构建的、包含2 000个重组自交系（recombination inbred line,RIL）的巢式关联分析群体（nested association mapping population,NAM）为试验材料,分别与改良瑞德×黄改系杂优利用模式的代表自交系郑58和昌7-2进行测交,并在全国4个玉米主产区10个试验点开展测交群体的多环境产量及重要农艺性状鉴定。在开展NAM测交群体产量和重要农艺性状相关性分析、各性状在NAM群体及其测交群体之间相关性分析基础上,基于高密度遗传图谱,利用联合逐步回归（Joint stepwise regression）模型进行了NAM及其测交群体QTL定位和产量QTL的复等位遗传分析,并对NAM及其测交群体定位QTL所在区域的遗传重组率进行了比较。【结果】表型分析结果表明,2个测交群体的株高和产量相关性状（主要是行粒数和百粒重）与小区产量均表现出较高的正相关关系。但强优势测交组合（郑58测交群体）的产量表现与NAM群体自身的产量表现相关性较低,表明相对于弱优势测交组合（昌7-2测交群体）,强优势测交组合的产量表现受RIL家系自身的产量影响较小。QTL定位结果表明,与NAM群体相比,利用其测交群体检测到的QTL数目较少,但能解释更高的表型变异。昌7-2和郑58测交群体定位到的QTL中,分别仅有27%和25%的位点与NAM群体定位结果重叠或相邻。主效位点的复等位分析结果表明,对于郑58测交群体（强优势测交组合）,在单穗产量QTL中,68.69%的增产等位变异来自骨干亲本黄早四。但在昌7-2测交群体中（弱优势测交组合）,仅有36.36%的增产等位变异来自黄早四。利用郑58测交群体共鉴定到13个重要的产量相关基因组区段,来自黄早四的等位变异在其中的11个区段表现为增产,这些区段对黄早四杂种优势的形成可能具有重要作用。QTL所在区域的重组率分析结果表明,利用郑58测交群体检测到的QTL所在区域具有较低的遗传重组率,符合杂种优势相关位点更容易分布于低重组区的基因组基本特征。【结论】在强优势测验种郑58遗传背景下,来自黄早四的等位变异对测交组合的产量具有重要遗传贡献,定位到的相关遗传区段与玉米杂种优势形成密切相关。     

微卫星开发技术研究进展

对国内外主要应用的6种微卫星开发技术直接文库筛选法、基于锚定PCR技术法、单引物延伸富集法、选择杂交富集法、生物信息学法、转移扩增法进行了综合评价。在结合自己的研究经历及近几年相关的文献报道的基础上,发现目前选择杂交富集法从技术难度、开发效率、开发微卫星的多态性水平3方面综合评价为最有效的微卫星开发技术;传统的直接文库筛选法由于工作量巨大目前报道较少;随着生物数据库核酸序列的不断增加,生物信息学法将会发展成为一种经济、快速、高效的微卫星开发技术;而锚定PCR技术则适合于微卫星文库的筛选,该法可以有效淘汰侧翼序列短而不能设计引物的无效微卫星克隆,因此提高了微卫星开发效率。     

拟南芥脱水诱导早期应答基因研究进展

ERD(脱水诱导早期应答基因)是可以快速应答干旱反应的基因,最早是在拟南芥脱水诱导1 h获得的。目前,在拟南芥中获得16个ERD基因,它们属于不同的基因家族,作用于不同的代谢途径,通过不同的方式增强拟南芥的抗旱性,除了具有快速应答干旱胁迫的特征,还具有应答冷、盐、衰老、ABA等多种逆境胁迫信号的特征。研究这些基因有助于了解拟南芥的抗旱机制。目前对ERD基因的诱导表达和转录调节研究的比较清楚,但是对其中多数基因的作用机制还没有深入研究。本文综述拟南芥脱水诱导早期应答基因的研究现状和研究意义。