口蹄疫病毒3B基因的高效表达及其表达产物的反应活性

通过PCR技术获得口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因,将其克隆至质粒pET-32a（＋）和高效可溶性表达质粒pEM中,经PCR筛选,获得阳性重组子pET-3B和pEM-3B,将它们转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果证明,表达的3B融合蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。蛋白可溶性分析表明,EM-3B融合蛋白绝大部分以可溶形式表达。以此可溶性融合蛋白EM-3B为抗原建立了可区分FMD免疫动物和感染动物的EM-3B-DIVA-ELISA方法,经检测,其特异性为95.0%,敏感性为97.5%,与2个国产试剂盒的符合率分别为96.25%和98.75%。     

胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因克隆、序列分析与组织分布

用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术特异性地扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（简称Gal-1）～Gallinacin-13（简称Gal-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank中获得胡须鸡β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因的注册号为：DQ858311~ DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，其氨基酸的同源性均在96.5～100％之间。利用Clustalx软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-1（a）、3在同一分支上，Gal-4、5、8在同一分支上，Gal-2、12、13在同一分支上，Gal-6、7在同一分支，Gal-9、10在同一分支，Gal-11独在一分支上。同样用RT-PCR方法分析了胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现:Gal-1/2/4/5/6/7/10的表达分布非常广泛，Gal-3/8/9/11/12/13的分布少。     

污染的水域是水禽流感病毒的温床，对其它禽类存在隐形的威胁 警惕禽流感病毒的隐形传播之势

由于水禽流感病毒主要是嗜肠道型,其复制主要是在肠道和呼吸道,因此病毒能以较高滴度从粪便中排出而污染水域、饲料、饮水、设备、笼具、蛋筐、衣服及其饲养场所,而人员的流动与消毒不彻底,通过病禽、尸体、禽肉以及羽毛收购和家禽交易等方面加大速度和范围,就可导致病毒的快速传播。水是重要的传播媒介,昆虫及乌和水禽的粪便是重要的病毒源。污染水域的水不经浓缩即可分离出流感病毒,流感病毒在22℃水中可保持感染性达4天以上,在0℃水中可保持感染性30天以上,还可通过粪便—口腔途径,或粪便—泄殖腔途径感染,并在体内不断传代。专家强调指出,水禽是禽流感病毒的天然宿主,所有亚型的流感病毒都可从水禽体内分离到。我们在对正常水禽进行流感病毒的监测过程中发现,可以从表现正常的水禽禽体内分离到H5N1、H9N2亚型禽流感病毒,这给这两种亚型禽流感病毒的隐形传播创造了很好的条件,造成了H5、H9亚型流感病毒在人们的麻痹中流行。同时还发现一株来源于正常禽群的H5N1亚型流感病毒的NS基因,可能来源于H7亚型流感病毒,可能是一新的自然重组病毒。等等这些都给养禽业造成隐性危害。而且,水禽对流感病毒的免疫有不同与鸡等陆生家禽的机理,如同样的禽流感疫苗在鸡体内可产生高且持续时间长的特异性抗体坚强抵抗外来病毒的侵害,而水禽产生的抗体却效价低且持续时间短,据此可以看出水禽对流感病毒的免疫虽以体液免疫为主,但水禽流感的细胞免疫绝对是不可忽视的值得深入研究的课题。专家提示养殖企业（户）,特别是病死水禽接触过的水,不能随便排放,必须进行严格消毒处理后再排放。由于水禽可带毒和隐性感染,所以畜禽不能混养,鸭、鹅与猪混养将有可能更容易导致禽     

黄羽肉鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定与全基因组序列分析

为了解J亚群禽白血病在黄羽肉鸡中的流行状况,采用病料研磨液接种DF-1细胞、ELISA p27抗原检测、PCR扩增等方法,从广东某鸡场送检疑似禽白血病的黄羽肉鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,命名为GDLZ0715。为进一步了解该病毒分子学特性,对其进行全基因组测序,并与其他ALV-J毒株进行比较。结果表明,GDLZ0715分离株整个基因组中gag、pol、env基因和LTR相对保守,与各参考ALV-J毒株序列同源性分别达93.5%~95.9%、96.8%~97.3%、89.6%~94.6%和90.8%~95.1%;3′UTR变异较大,与各ALV-J参考毒株序列同源性仅为80.5%~93.4%,其中rTM和E元件大量碱基缺失;进一步分析表明3′UTR中rTM区和E元件大量碱基缺失正成为我国肉鸡ALV-J毒株的变异趋势。     

口蹄疫病毒泛亚株衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和鉴定

以pT-P1质粒为模板,应用引物对P1-S2/P1-A2进行PCR扩增,获得口蹄疫病毒（FMDV）泛亚株全衣壳前体基因（P1）片段.用EcoRI 酶切并连接将P1克隆入表达载体pSOC中,以引物对Pr.78/P1-A2进行PCR扩增,鉴定P1基因插入方向正确.在大肠杆菌中以P1-SOC融合蛋白（约98ku）的形式获得高效表达（21%）.在0.5～3 mmol/L IPTG诱导浓度和37 ℃220 r/m振摇培养1～4 h条件下表达量保持稳定.表达产物经T4-3C蛋白酶作用,裂解后可产生多种蛋白.出现与抗口蹄疫血清反应的蛋白条带.     

胃泌酸调节素研究进展

胃泌酸调节素(OXM)是由小肠L细胞分泌的一种肽类激素,它能够透过血脑屏障到达下丘脑弓状核,与其特异性受体结合后发出饱感信号终止动物进食.胃泌酸调节素对动物食欲的调节和内环境稳态的稳定,是通过抑制胃酸分泌、降低采食量、增加能量消耗及动员脂肪分解等生物学功能实现的.论文综述了近年来国内外学者对胃泌酸调节素在来源及结构、生物学功能和作用机理3个方面的研究成果,并阐述了对其进行进一步研究的发展方向.     

J 亚群禽白血病病毒受体基因NHE1 的遗传多态性分析

为发掘J亚群禽白血病病毒(ALV-J)受体基因NHE1潜在的遗传抗性位点,采用PCR技术分段扩增NHE1受体基因序列,并分析其遗传多态性。结果显示,在黄羽肉鸡NHE1基因外显子区域发现了16个SNP突变,分别为c.309GC,c.11653CT,c.11689GA,c.11917CT,c.11946CT,c.13405CA,c.13429TC,c.13438TC,c.14108AC,c.14516AG,c.14522GA,c.14654CT,c.15834GA,c.15873GA,c.17560CGandc.17770GA。进一步分析表明这些SNP突变均为同义c SNP,未引起氨基酸发生改变;在黄羽肉鸡NHE1基因内含子区域发现了SNP和插入/缺失突变,NHE1基因内含子2c.12239~12240和c.13114~13115分别存在AGGGCTGC和TGAAGCC插入突变,内含子11c.17073~17091存在TGTCCTGTGTCCTCCCTGC缺失突变;在ALV-J攻毒后阴性鸡和阳性鸡的NHE1基因外显子区域均发现c.309GC、c.11653CT、c.13405CA、c.13438TC、c.14108AC和c.14516AG6个SNP突变,内含子区域也均发现与黄羽肉鸡相同的插入/缺失突变。研究结果表明,发现的NHE1受体基因遗传变异位点不能作为ALV-J潜在的遗传抗性位点。     

应用RT-PCR技术快速检测鸭I型病毒性肝炎

根据Genbank收录的I型鸭肝炎病毒(DHV-I)的VPI基因保守序列,设计合成特异性引物,建立了检测DHV-I的RT-PCR方法.并确定了该方法的特异性与灵敏性;对DHV-I分离毒株进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果.而作为阴性对照的常见4种鸭病病原如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、鹅副粘病毒均未成功扩增;对DHV-I临床病料进行RT-PCR检测,检测结果与病毒分离结果一致.结果表明,建立的DHV-I的RT-PCR技术具有快速、特异、灵敏的特点.     

广西黄鸡β-防御素基因的克隆、序列分析与组织分布

用设计的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增到广西黄鸡β-防御素基因gallinacin-1(简称Gal-1)-galllnacin-13(简称Gal-13).通过克隆、测序获得这13个基因的cDNA核苷酸序列,并提交到GcnBank(Gal-1-Gal-13基因的注册号为:DQ858297～DQ858310).比较分析广西黄鸡13种β-防御素Gal-1-Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的相似性,其氨基酸的相似性均在95.5%～100%之间.利用DNAStar软件对所获得的13种广西黄鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果Gal-1与Gal-5、Gal-12、Gal-2在同一分支上,Gal-6、Gal-7、Gal-9、Gal-8在同一分支上,Gal-10、Gal-11、Gal-4在同一分支,Gal-13独自为一分支.同样用RT-PCR方法分析了广西黄鸡β-防御素Gal-1-Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12、Gal-13的分布较少.     

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析(英文)

[Objective] The study aimed to lay a foundation for the further studies on function mechanism of NS1 protein in the interspecies transmission of waterfowl influenza virus. [Method] Using the serologic assay and the specific RT-PCR method, some strains of H9 subtype waterfowl influenza virus were isolated from the 12 to 20 day-old muscovy duck flocks without any clinical symptoms in different areas of Guangdong Province. Four of these strains, including A/duck/ZQ/303/2007(H9N2) (A3 for short), A/Duck/FJ/301/2007(H9N2) (C1 for short), A/Duck/NH/306/2007(H9N2) (D6 for short), A/duck/SS/402/2007(H9N2) (E2 for short), and a strain named A/duck/ZC/2007(H9N2) (L1 for short) from a muscovy duck died of avian influenza virus (AIV), were used for NS1 gene cloning and sequencing. Subsequently, the obtained NS1 gene sequences were compared with other NS1 sequences registered in GenBank, and the phylogenetic analysis was also conducted. [Result] When compared with the H9N2 AIV NS1 sequences in GenBank, the NS1 genes of the four AIV strains A3, C1, D6 and E2 displayed homologies ranging from 99% to 100% at nucleotide level, and 95% to 100% at amino acid level; while the NS1 gene of L1 strain displayed homology ranging from 94% to 97% at nucleotide level, and 93% to 98% at amino acid level. The phylogenetic tree demonstrated that A3, C1, D6 and E2 were highly resemblant, and L1 was closest to AY66473 (chicken, 2003). By comparison with the NS1 gene sequences of L1, AF523514 (duck), AY664743 (chicken) and EF155262.1 (quail) using DNAstar, A3, C1, D6 and E2 presented nucleotide variations at site 21(R→Q), 70, 71(KE→EG), 86 (A→S), 124 (V→M) and 225 (S→N), and amino acid variations at site 21, 70, 71 and 86 in dsRNA-dependent protein kinase (PKR) binding domain of NS1 gene, which induced the evident variations of antigenic determinant and surface probability plot of NS1 protein. [Conclusion] This study suggested that the amino acid sequence variation in PKR binding domain of NS1 protein had something to do with the virus pathogenicity.