利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。     

气吸式精量播种机风机气流场仿真试验研究

FL风机作为气吸式播种机核心部件,为气吸式播种机提供排种负压。为此,针对气吸式播种机排种负压输出不稳定的问题,对风机内部流场进行了仿真分析。采用UG10.0软件对风机进行实体建模,应用ANSYS/CFD软件,对风机转速、进口直径、进口流速进行单因素仿真试验,并根据试验结果设计正交试验,对排种器正常工作时风机气流场进行仿真研究及试验验证。结果表明:风机进口直径为120mm时,实际功耗为5.3kW,效率为0.71;风机进口流速为11.05m/s时,实际功耗为5.1kW,效率为0.68,在误差允许的范围内,与仿真结果相吻合。     

浙江省农田土壤碳氮比特征及影响因素分析

利用浙江省近期地力调查获得的数据探讨了全省农田土壤有机碳与全氮的关系、碳氮比的变化规律及其影响因素。结果表明,浙江全省农田土壤C/N比平均为10.13,主要在8～11之间,显示出较高的肥力特征。随着土壤粘粒的增加,农田土壤C/N比呈现下降的趋势,土壤C/N与土壤全氮含量呈负相关。不同土壤类型农田土壤的C/N:新造水田>潜育型水稻土>淹育型水稻土>脱潜型水稻土>潴育型水稻土、渗育型水稻土。近30年氮肥投入的显著增加没有降低土壤C/N,表明浙江省农田土壤碳氮基本接近平衡,过多的氮肥施用已难以被土壤固定,却可增加氮素的流失,对环境产生负面影响。土壤氮素只有与秸秆还田、增施有机肥等同时提高土壤碳素才能有效积累。     

CRISPR/Cas9技术在观赏植物改良育种上的应用进展

CRISPR/Cas9技术是继ZFN、TALEN后目前新兴的基因定点改造技术手段。本文将简要介绍CRISPR/Cas9技术的发展演化及优势,总结其在观赏植物上的应用现状及巨大潜力。目前该技术已成功应用于百脉根、毛白杨、铁皮石斛、苜蓿、矮牵牛、日本牵牛花、菊花、兰猪耳、菊苣等观赏植物上,为在观赏园艺上的性状改良、基因工程研究提供了有力依据和手段。     

亚慢性砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡的影响

为研究砷暴露对小鼠心肌组织损伤及细胞凋亡的影响,试验选用40只5周龄C57BL/6小鼠,随机分为4组(对照组饮用去离子水,低、中、高剂量砷暴露组分别饮用含0.15、1.50、15.00 mg/L三氧化二砷的去离子水),90 d后检测各组心脏脏器系数、血清心肌酶谱活力、心肌细胞凋亡率及凋亡通路相关基因的表达。结果表明,不同浓度砷暴露组的心脏脏器系数均有所下降,其中,中、高剂量组与对照组相比差异显著;与对照组相比,中、高剂量组血清肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟基丁酸脱氢酶(HBDH)活力显著升高,低剂量组各项指标变化不明显。TUNEL法检测显示,对照组中未发现有凋亡心肌细胞,各剂量砷暴露组心内膜和心外膜下均可见不同数量的凋亡心肌细胞分布。与对照组相比,心肌组织Bax的表达在中、高剂量组显著上调;Bcl-2的表达在中、高剂量组显著下调;Caspase-3的表达在高剂量组显著上调。亚慢性砷暴露对小鼠心肌造成特异性损伤,且随着染毒剂量的增加损伤程度加重;诱导心肌细胞凋亡是砷暴露致心脏毒性的重要机制。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2），在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序，结果表明，共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变，编辑效率为32%；突变体植株生长势较弱，叶片较小，茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测，结果表明，接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后，突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝，表皮细胞产生大量明显的H2O2，而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器，无明显H2O2产生。这些结果表明，可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2，提高葡萄白粉菌抗性。     

枣AP2/ERF转录因子鉴定及其响应枣疯病植原体表达分析

利用生物信息学方法，从植物转录因子数据库和NCBI数据库中分别得到175和164个候选的枣AP2/ERF转录因子序列，使用DNAMAN软件进行序列比对、去除重复序列，采用SMART软件预测蛋白结构域发现，枣基因组中包含有145个AP2/ERF基因，其中ERF、AP2、RAV亚家族分别含有116个、23个、5个，另有1个独立基因。预测枣AP2/ERF转录因子氨基酸数量在111 ~ 692之间，分子量在12 446.87 ~ 76 154.10之间，pI在4.31 ~ 10.11之间。鉴定出的145个AP2/ERF转录因子，105个分别定位到12条染色体上，40个未能定位。在此基础上，利用嫁接病芽方法将枣疯病植原体转至健康枣植株，通过转录组测序和qRT-PCR手段，分析了AP2/ERF转录因子对枣植原体侵染的响应，在植原体侵染枣的6个不同时期，枣AP2/ERF表达数量和表达量均不相同，共有48个差异表达基因，其中ZjAP2*9、ZjERF49和ZjERF91是响应枣疯病植原体最为重要的AP2/ERF转录因子。     

‘王林’苹果苦痘病的防治试验

近几年来‘王林’苹果苦痘病的发病率较高,为了探索防治办法,2018—2019年在瓦房店市驼山乡大魏村‘王林’苹果园进行施用“聚能螯合钙+硅”+生物有机肥试验。结果表明:第1年好果率达到90.2%,比对照提高15.0%;第2年分别为96.82%、22.23%。病果的病斑数也明显减少。     

无机碳源对零价铁介导的自养脱氮序批式反应器处理高氨氮废水的影响

无机碳源作为自养微生物的能量来源,是影响自养脱氮细菌富集的重要因素。文章通过添加不同量的KHCO3作为ZVI介导的自养脱氮体系中无机碳源,研究反应体系的脱氮效果影响趋势以及适宜的无机碳源添加量。结果如下:1)KHCO3作为无机碳源可以显著提高NH^+4-N去除率,KHCO3添加量越多,其NH^+4-N去除率越高。KHCO3添加量分别为2 g,1 g,0.5 g的SBR反应器R2,R1,R0.5的NH^+4-N去除率分别为98.39%,65.18%,44.56%,相较不添加KHCO3的R0分别提高86.5%,53.29%,32.67%。ZVI的添加会降低KHCO3对NH^+4-N氧化的促进作用。2)KHCO3可明显提高TIN去除效果,促进总氮脱除的高低顺序是R1>R0.5>R2,SBR反应器R2,R1,R0.5的平均TIN去除率分别为19.01%,32.04%,27.62%,相较于空白组R0分别提高了10.60%,23.63%,19.21%。3)KHCO3可中和硝化反应产生的H^+,对反应体系具有缓冲作用,可使微生物处于较适宜的酸碱环境中,更有利于反应器的稳定运行。4)适量的无机碳源KHCO3可以促进氨氧化细菌和厌氧氨氧化细菌的活性。该研究探讨了无机碳源在零价铁脱氮体系中的影响趋势,为铁型脱氮技术提供了理论支撑。     

硅铝凝胶改性防腐剂对竹材表面颜色的影响

为考察硅铝无机防腐处理对竹材表面颜色的影响,以毛竹为材料,采用不同热处理溶液浓度(0、 25%、 50%、 100%)、处理温度(140、 160、 180℃)和处理时间(1、 2 h)分别对其进行处理。依照标准色度系统指定表征防腐处理前后竹材表面颜色,通过颜色总色差、明度、红绿色指数、蓝黄色指数的变化,探讨防腐处理工艺参数对竹材表面颜色的影响。通过傅里叶红外光谱和X衍射光谱分析防腐液与竹材结合方式,并使用场发射扫描电子显微镜观察对比处理前后防腐液在竹细胞腔内的分布情况。结果表明,防腐液浓度对竹材色差变化影响较大,随着浓度的增大,竹材色差也随之增大。热处理工艺的处理温度与处理时间对竹材表面颜色的影响也符合传统木材热处理色差变化规律。微观检测发现,防腐剂不仅与纤维有化学键结合,也通过物理吸附以分子团聚形式附着填充在细胞腔内部。