河南省规模化猪场支气管败血波氏杆菌的流行病学研究

为了解河南省规模化猪场支气管败血波氏杆菌的流行病学情况,2015—2017年应用染色镜检、生化试验和PCR检测等方法进行支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)的分离与鉴定,从全省规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状猪的1 022份样品中,共分离鉴定到82株Bb,总分离率为8.0%。其中,有30份组织病料只分离出波氏杆菌,52份共感染病料以S.suis,HPS,E.coli,Pm居多,且鼻拭子分离率低于肺脏组织。说明Bb在河南省猪群的感染十分普遍,且与其他细菌协同感染情况非常普遍,在猪萎缩性鼻炎的发生中具有重要作用。     

河南省猪肠外致病性大肠杆菌毒力因子的检测及分布

为探讨河南省猪肠外致病性大肠杆菌的毒力因子及分布情况,试验设计16对引物,分别扩增猪肠外致病性大肠杆菌及其15个毒力因子,2017年1—12月从河南省猪场采集的各种组织病料148份中分离鉴定出52株猪肠外致病性大肠杆菌,进行了小鼠毒力试验和15个毒力因子的扩增。结果表明,河南省猪肠外致病性大肠杆菌感染率较高,分离株均对小鼠有毒力,ompA,traT基因在所有分离株中都含有,其次为fimH,iutA,vat,iroN基因,最少的是usp,kpsMTⅢ基因;分离株含有的毒力基因最多10个,其次为9个,最少的仅含2个。     

猪流行性腹泻病毒CH-HeNXX-2017株全基因组序列测定与分析

为了解猪流行性腹泻病毒在河南流行毒株全基因组遗传进化水平,应用RT-PCR方法从疑似猪流行性腹泻病毒感染的病料中扩增出全基因组序列,并将PCR产物纯化后连接pMD20-T载体,转化JM109感受态细胞,挑选单克隆进行测序,获得的序列经过DNA STAR中Edit Sequence软件对全基因组序列进行拼接。结果表明,猪流行性腹泻病毒CH-He NXX-2017株全长28 038 nt(除去poly A);进化树分析显示,该毒株与IA1,USA Colorado2013,MN和PC22A等毒株亲缘关系较为接近,与国内外早期分离株如CV777,LZC,DR13等毒株亲缘关系较远。揭示猪流行性腹泻病毒一直处于不断的进化中,需要一直密切监控病毒进化趋势,为临床诊断以及疫苗研发等提供理论参考。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)快速、特异的检测方法,减少猪流行性腹泻(PED)给养猪业带来的损失,根据PEDV的S基因序列设计1对引物,优化扩增条件,建立了针对PEDV的RTPCR检测方法。结果显示,建立的检测方法可特异地检测出PEDV。应用建立的检测方法对2016年河南地区38家发生腹泻的猪场的256份病料进行检测,结果表明,阳性猪场为30家,阳性样本为157份,检出率高于试纸条检测方法。可见,建立的检测方法特异性强,可用于PEDV感染疑似病例的诊断及流行病学调查。     

PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。     

河南省规模化猪场猪链球菌2型的分离鉴定和药敏试验

从2006-2009年河南省发生猪高热综合征的113家规模化猪场291份病料中分离革兰氏阳性球菌,通过培养特性试验、生化试验、猪链球菌和猪链球菌2型的PCR试验,结果鉴定125株为链球菌,其中35株为猪链球菌2型。对35株猪链球菌2型进行小鼠毒力试验及药敏试验,结果显示,35株猪链球菌2型对小鼠均有毒力,均对头孢噻肟、头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、氯霉素、环丙沙星、氧氟沙星敏感。     

副猪格拉菌血清 2 型毒力及耐药性分析

【目的】副猪格拉菌是引起猪格拉泽氏病的病原，是危害养猪业最为严重的细菌性病原之一，该菌血清型众多，不同血清型之间交叉保护力弱。血清 2 型是中等毒力毒株，近年来临床分离比例越来越高，危害越来越严重。从河南某规模化猪场保育猪群分离到副猪格拉菌血清 2 型并进行系列试验，为科学防控该病提供参考。【方法】对副猪格拉菌临床疑似病例猪只无菌采集肺脏、气管、心血等样品，通过细菌分离纯化、革兰氏染色镜检、常规 PCR、豚鼠致病性试验及琼脂扩散药敏试验等方法，对疑似细菌进行形态观察、鉴定、血清型分型、毒力基因检测、耐药基因检测、致病性和耐药性等一系列生物学特性研究。【结果】从肺脏样品中分离获得 1 株副猪格拉菌，经鉴定为血清 2 型，该菌株携带 vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2 毒力基因，对豚鼠有较强的致病力。该菌株携带有 aadA1、strA、strB、aphA1、tet(B)、sul2 多个耐药基因，对青霉素 G、卡那霉素、阿米卡星、链霉素、四环素、土霉素、复方新诺明有较强的耐药性；对头孢噻呋、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、左氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星敏感性较好，临床用药效果显著。【结论】分离出的副猪格拉菌 2 型菌株毒力较强，且能透过血脑屏障，有明显的多重耐药性。研究结果可为副猪格拉菌血清 2 型流行病学调查、致病机制研究以及临床防控措施制定提供参考。     

携带新德里金属β-内酰胺酶的猪源大肠杆菌全基因组测序及植物提取物药物筛选

为了解大肠杆菌携带新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM）NDM耐药基因情况及筛选敏感植物提取物，为携带NDM的超级耐药大肠杆菌的防控和药物研究奠定基础。采用16S rRNA菌种鉴定，PCR筛查菌耐药基因，blaNDM、blaTEM和AmpC酶耐药基因的确认，全基因组测序，BLAST和MEGA软件对序列进行生物信息学分析、系统进化树分析、NDM亚型鉴定和6种植物提取物药敏药物筛选研究。结果表明，从2021年（1-12月）临床猪腹泻病例中分离鉴定的91株大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）中鉴定出1株同时携带新德里金属β-内酰胺酶NDM4、NDM5和β内酰胺酶blaTEM、AmpC酶的大肠杆菌（HN2187）。对其进行11种抗生素和6种植物提取物药物敏感性测试，结果显示HN2187菌株对其均耐药。而HN2187对血根碱、贯叶连翘提取物敏感，对黄芩、姜黄素、千里光和大蒜提取物耐药。HN2187产B类酶，携带NDM4、NDM5、blaTEM、AmpC酶耐药基因，其中blaNDM-4位于质粒pNDM4-HN2187（Plasmid B）上，blaNDM-5位于质粒pNDM5-HN2187（Plasmid A）上，blaTEM1位于质粒pTEM1-HN2187（Plasmid B）上，AmpC酶耐药基因位于染色体上，分别介导blaNDM-4、blaNDM-5、blaTEM和AmpC耐药基因，是耐药菌传播的重要载体。以上研究表明，携带NDM4和NDM5的多重耐药菌已在养殖场传播和流行，应加强该类耐药基因的流行调查、监测和新药物研究，为临床超级细菌和多重耐药菌感染的流行和防治提供理论基础。     

胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株与敏感菌株的差异蛋白质组学分析

为了解猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌临床分离菌株与标准菌株蛋白质差异表达情况，采用定量差异蛋白质组学研究策略，以临床分离菌株(HN201616)与标准株(CVCC261)的细菌全蛋白质为研究对象，鉴定差异表达蛋白质及生物信息学分析。结果显示：共鉴定出1 373个蛋白质，其中显著差异的蛋白质数为395个[显著性差异蛋白质数目按照差异倍数(FC)≥1.5和FC≤0.67,P≤0.05进行相应的筛选],包括上调蛋白质205个，下调蛋白质190个；鉴定出的与抗生素耐药相关的蛋白质主要有二氢叶酸还原酶、外膜蛋白、麦芽糖蛋白、二氢蝶酸合成酶、谷胱甘肽转移酶、丙酮酸激酶、谷氨酰水解酶、ATP-结合盒家族蛋白等。这些结果将有助于深入探索猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药机制，为研发新型抗菌药剂和筛选潜在药物靶点提供思路。