猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

试验以猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）的ORF5和猪圆环病毒2（PCV-2）的ORF2为目的基因,以pIRES-neo为表达载体,构建了PRRSV—PCV-2二联核酸疫苗,并对其免疫原性进行了初步的研究,为研制安全有效的疫苗防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供基础。     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

1材料与方法 1．1材料限制性核酸内切酶HindIII、BamHI、PvuII、SspI、质粒抽提试剂盒、EcoT14 DNAMarker购自TakaRa公司。T4DNA连接酶购于promega公司。大肠杆菌DH5α菌株由该实验室保存。siRNA表达载体pSilencer 4．1-CMV Nero质粒购自Ambion公司。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增出PRRSV甘肃株的核衣壳蛋白(N)基因,将N基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含N基因的阳性重组质粒pGEM-T easy-N.对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAStar分析所测序列与GenBank中已登录的PRRSV毒株的同源性,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达载体pGEX-4T-1-N,转化E.coliBL21(DE3)细胞,用SDS-PAGE检测表达产物,并对其进行纯化.结果表明:PRRSV甘肃株N基因核甘酸序列与PRRSV-VR2332株的同源性为93.3%,与欧洲LV株的同源性为66.1%;构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得了成功表达,表达产物为40ku的可溶性融合蛋白.     

两株高致病性PRRSV河南分离株ORF5基因克隆及遗传变异分析

从河南信阳和新乡两地区猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc145细胞病变的病毒,命名为HN1和HN2。采用RT-PCR方法从分离的2株PRRSV中均分别扩增出ORF5基因,并将其克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较,绘制系统进化树,结果表明,ORF 5核苷酸与北美洲型的同源性为81.2%～99.1%,与欧洲型Lv株的同源性分别为35.9%和35.3%,推导氨基酸与北美洲型的同源性为84.5%～99.5%,与欧洲型Lv株的同源性分别为46.0%和45.5%。证明新分离到的PRRSV毒株仍属北美洲型。与国内分离的高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB1、JX0612、GDZC1、ZQ、SX-1、HB1、HEB1、Hnyz核苷酸同源性达96.5%～99.1%,氨基酸同源性为96.0%～99.5%。分析结果表明,所获得的2个毒株GP5蛋白氨基酸序列中的抗原表位已经发生变异。     

PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株M基因的原核表达与重组蛋白的复性研究

采用PCR方法从重组质柱pTG19-T-M扩增得到缺失N端疏水区序列的基因片段tM.将tM与原核表达载体pET-32a进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序.结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21细胞中成功地表达了醉繁殖与呼吸病毒重组蛋白pET-tM.表达量为31%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为29 kD的重组蛋白且以包涵体形式存在.8 mol·L~(-1)尿素变性溶解包涵体,再用稀释与透析相结合的方法对重组蛋白进行复性.复性蛋白经Western-blot检测,结果证明复性蛋白可被PRRSV阳性血清识别用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学研究

【目的】确定新疆南疆猪养殖场是否存在PRRSV感染,以及感染的PRRSV毒株类型及基因特点,从而针对性的有效防制PRRS。【方法】设计7对引物,对疑似PRRS发病猪场组织样品进行RT-PCR、克隆、测序和序列分析。【结果】47例样品,35例PRRSV阳性,阳性率高达74.47%（35/47）;35株均为美洲型毒株,其中有10株属于高致病性PRRSV,占总检测样品的21.28%（10/47）,占阳性样品的28.57%（10/35）;综合分析本研究采集样品猪养殖场不存在欧洲型毒株。【结论】新疆南疆存在美洲型PRRSV感染,且存在高致病性毒株。     

2006年-2008年河南省PRRSV分子流行病学调查

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。     

抗菌肽Dermaseptin S4体外抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的活性

探讨抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)体外对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的抑制作用,为研制抗PRRSV病毒药物提供理论依据.该研究以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,采用不同的给药方式(同时、感染前、感染后),运用噻唑篮(MTT)比色法观察细胞病变,测定最大无毒浓度TC0和半数细胞感染量(TCID50),以吸光度值(OD490nm)、细胞存活率和DS4对PRRSV的抑制率为指标,确定DS4对PRRSV的抑制强度.结果表明:抗菌肽Dermaseptin S4体外对PRRSV的直接灭活效果最好,与药物拉米夫定对照组相当,且抑制强度与其浓度呈显著正相关,R2=0.998 3.