多胎与单胎山羊发情期卵巢褪黑素受体基因的克隆测序分析

为揭示褪黑素影响山羊繁殖性状的遗传机制,本研究采用差异显示PCR(DDRT-PCR)和克隆测序技术,研究了褪黑素受体1a(MelR1a)基因在多胎的济宁青山羊和单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中的表达情况,并对MelR1a基因进行了克隆测序分析。检测结果表明,MelR1a在两种山羊卵巢中均有表达,说明,褪黑素可以通过分布于卵巢中的褪黑素受体而对山羊的生殖发挥重要的调控作用。克隆测序分析结果表明,两种山羊发情期卵巢组织中褪黑素受体1a基因的碱基组成没有变异,说明山羊褪黑素受体基因序列具有高度的保守性。     

抗禽流感病毒免疫相关基因的筛选与鉴定

 【目的】研究抗禽流感病毒免疫的分子机制,发现新的抗禽流感病毒免疫相关基因,为抗禽流感转基因育种的研究奠定基础。【方法】随机选取40只30日龄AA白羽肉鸡,其中20只鸡注射禽流感H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,在注射后第9天取脾脏保存在液氮中。应用mRNA差异显示技术,结合反向northern dot blot鉴定技术,来筛选注射疫苗组和未注射疫苗组的差异表达基因。【结果】筛选出13条差异表达EST,其中未注射疫苗组4条,注射组9条表达量增高。应用BLAST工具将EST对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高相似性,为已知的EST,但功能未知。DD10、DD13与鸡核糖体蛋白L7a基因具有很高的相似性。DD1、DD2、DD5、DD8为新的EST,提交到GenBank,分别获得登录号为EB714185、EB714186、EB714187、EB714188。【结论】本研究筛选出的鸡核糖体蛋白L7a基因和其它EST对应的未知功能基因可以作为抗禽流感病毒研究中的候选基因,其具体的功能有待今后进一步研究。     

蜡梅花被片mRNA差异显示分析体系的建立与优化

以同一单株狗蝇蜡梅的中被片、内被片为材料,首次将mRNA差异显示技术用于蜡梅花被片的研究.建立了蜡梅优化的mRNA差异显示分析体系,并获得了29个阳性片段,为后续的分离克隆蜡梅中被片、内被片颜色差异表达的基因奠定了基础.     

超级杂交水稻两优培九光抑制差异表达基因的遗传来源

 利用改进的银染mRNA差异显示技术研究杂种超级杂交水稻两优培九及其母本培矮64S和父本9311在光抑制胁迫条件下基因表达的变化，共得到了杂种的167个差异表达基因片段。对这些差异片段进行分类和遗传来源分析表明，杂种光抑制差异表达基因多数为父母本所共有，是母本和父本共同遗传的结果。少数基因表现为母本或父本的单亲特异性，或无明显亲本来源，说明某种未知机制可能参与了光抑制相关基因从亲本到杂种的遗传过程。     

利用DDRT-PCR研究丝羽乌骨鸡与AA肉鸡肝脏基因表达的差异

利用mRNA差异显示技术研究丝羽乌骨鸡(SK)与引进的快大型肉鸡品种爱拔益加肉鸡(AA)之间肝脏组织基因表达的差异.采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段,利用单链构象多态性(SSCP)技术验证差异显示片段的重扩增产物成分的单一性,采用反向Northern斑点杂交技术对获得的差异显示cDNA片段进行了差异真实性的鉴定.共获得了丝羽乌骨鸡与AA肉鸡差异表达cDNA片段38条,其中26条为丝羽乌骨鸡肝脏表达,而AA肉鸡不表达;其余12条为AA肉鸡肝脏表达,而丝羽乌骨鸡不表达.该结果为进一步研究丝羽乌骨鸡特异基因的表达探索了一种可行的方法,并积累了一定的基础资料.     

花生果种皮特异表达基因候选片段的分离

应用改良的琼脂糖凝胶电泳展示DDRT—PCR产物的方法分离花生果种皮特异表达基因，共分离出24条差异表达片段．经测序后排除重复，最终得到8条差异片段．其中1条为花生上已知基因片段，余下7条均为花生上尚未报道过的基因．此7个片段序列已登录Genbank，其登录号分别为DQ450065、DQ450066、DQ450067、OQ450068、DQ450069、OQ450070、DQ450071．同时本研究还对应用琼脂糖电泳分离DD—PCR产物的方法进行了探讨．     

芸芥自交不亲和等位基因及其表达初步研究

在利用芸芥自交不亲和系途径开展育种研究的过程中 ,为了避免在人工试配组合时,双亲蕾期杂交结籽率较好,但在自然隔离条件下配制杂交种 时出现双亲花期交配不亲和的现象,本试验对10份芸芥进行了系内株间和系间的完全双列杂 交,同时对自交不亲和基因的表达器官进行了DDRT-PCR扩增研究。结果表明,芸芥1、芸芥3 、芸芥5、芸芥6、芸芥8、芸芥9和芸芥13这7份材料系内株间异交和套袋自交的亲和指数均 小于1,即表现为不亲和性,说明这些材料属于S等位基因纯合的不亲和系;而芸芥2、芸芥4 和芸芥10这三份材料系内株间异交和套袋自交时,呈现出不亲和性不稳定的现象,即一部分 杂交表现为亲和,另一部分杂交表现为不亲和,说明这3份材料的自交不亲和性尚未稳定。D DRT-PCR扩增结果表明,芸芥自交不亲和S基因只在柱头组织中表达,其属于组织特异性表达 。因此,在利用自交不亲和系途径培育一代杂种时,在农艺学性状和自交不亲和性基本稳定 时,有必要进一步测定自交不亲和系S等位基因的纯合性和基因型,这一工作可以有效地指 导育种实践。     

DDRT-PCR技术在研究附植前胚胎基因表达中的应用

哺乳动物附植前胚胎的发育受相应基因的调控,在不同的发育阶段表达不同的差异基因,分离并克隆差异表达基因,有利于了解胚胎发育的分子机理.本文对mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的基本原理、特点,单胚差异显示技术(SPEDDRT-PCR)在研究动物特定发育阶段表达的基因的优点,以及对不同种类动物早期胚胎在特定发育阶段表达的基因进展情况作了介绍.     

月季切花衰老相关基因的差异显示及其序列分析

摘要：通过对不同瓶插寿命切花月季（Rosa hybrida）品种的DDRT-PCR方法，从长寿命的Pavarotti花瓣中扩增出22条cDNA特异片段，共得到9个cDNA片段的克隆，分别命名为b21、b32（b33）、b43、b51（b52、b814）、b618（b101、b108、b813）、b624、b131、b134和b186。序列测定和同源性检索的结果表明，来自b6的2个克隆b618和b624的序列不同，其中一个片段b618为439 bp，其氨基酸序列与拟南芥（Arabisopsis thaliana）、柑橘（Citrus sinensis）、萝卜（Raphanus sativus）、苹果（Malus sp.）、葡萄（Vitis vinifera）和胡颓子（Elaeagnus umbellata）等查尔硐异构酶(CHI)相应区域的同源性为71%~79%；另一个片段b624为440 bp,其氨基酸序列与拟南芥、豌豆（Pisum sativum）、欧洲油菜（Brassica napus）等的磷酸乙酰胆碱胞苷转移酶(CPCT)相应区域的同源性高达86%~90%。RT-PCR验证表明这2条cDNA片段为阳性结果。CHI涉及类黄酮色素的生物合成途径，CPCT参与胞苷二磷酸胆碱的合成途径，二者均与衰老进程相关。     

水杨酸诱导的甜瓜DDRT-PCR分析及其基因差异表达片段的分离

利用DDRT-PCR技术,比较了1 mmol/L SA诱导第4天与未经SA诱导的甜瓜感白粉病品种卡拉克赛的基因表达差异.共获得差别条带19条,在SA诱导后出现差异带15条,在未诱导的对照中出现差异带4条.对其中的8条差异片段回收、克隆,用EcoRI/HindIII双酶切和PCR扩增.对其中的cDNA3-4-1测序,在BLAST上比较同源性,发现其与拟南芥热激转录因子hsf8基因具有83%的核苷酸同源性.说明1 mmol/L SA处理的甜瓜叶片在mRNA水平上发生了明显的变化,SA诱导了热激转录因子hsf8基因的大量表达,从而可能影响热激蛋白hsp70的表达,对维持蛋白质结构,稳定胞内环境具有积极作用.