花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因AhLEAL的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

低温、高盐和干旱等非生物胁迫严重影响花生的生长和产量,而花生中有关非生物胁迫的研究及抗性基因的挖掘较少。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是一类亲水性蛋白,其功能主要是参与调控植物应答脱水相关的非生物胁迫包括耐盐、抗旱和抗冻等。本研究以花生品种花育33号为试验材料,根据cDNA文库中已知的胚胎发育晚期丰富蛋白基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因。该基因全长为555bp,开放阅读框为291bp,编码97个氨基酸。核苷酸序列比对表明,该基因与花生中已注册基因AhARG2(XM_016113504)同源性为100%,与AhLEA6-1(HM543588)同源性为99%。蛋白序列比对分析表明,该基因编码的蛋白与Genbank上已经注册的沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、牧豆树(Prosopis juliflora)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等植物中的胚胎发育晚期丰富蛋白同源性达到近65%。我们将该基因命名为AhLEAL(Arachis hypogaea Late Embryogenesis Abundant Like)。预测该基因编码的蛋白可能定位于细胞液、线粒体、内质网和叶绿体中。荧光定量PCR结果显示,AhLEAL在花生叶片和根中的表达受低温和高盐胁迫的强烈诱导,在根中受干旱胁迫的强烈诱导,说明该基因可能参与了花生对三种非生物胁迫的适应性调控;此外,AhLEAL在花生叶片和根中的表达也明显受ABA的诱导,说明该基因对花生逆境胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。     

花生脂磷酸磷酸酶基因家族的克隆与表达分析

为探究脂磷酸磷酸酶(LPP)基因家族在花生中的功能,本研究从花生中克隆得到8个LPP基因,分别命名为AhLPP1、AhLPP2、AhLPP4、AhLPPβ1、AhLPPβ2、AhLPPγ、AhLPPδ、AhLPPε,分别编码335、322、284、228、198、227、403和293个氨基酸,均属于LPPs蛋白质家族。随后对克隆的基因进行序列相似性比对和系统发育分析;同时通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测AhLPP基因在花生不同组织、不同发育时期、5种激素和4类非生物逆境胁迫下的表达情况。结果显示,这些基因与其他植物的LPPs蛋白有较高的相似性,可能参与花生种子油脂的合成。在5种激素与4类非生物胁迫处理下AhLPP2、AhLPPγ、AhLPPε基因均显著诱导表达,其余LPP基因在部分处理下显著诱导表达。本研究为阐明LPP类基因在花生油脂合成和逆境胁迫抗性的功能奠定了理论基础,丰富了花生品种改良的基因资源。     

76个花生品种(系)果柄强度的研究

果柄强度是影响花生机械收获的重要农艺性状。本研究对76个花生品种(系)进行了果柄强度、产量和品质的测定。筛选出适宜机械化收获的大花生新品系6个:R17-9,P17-91,P17-70,P17-68,P17-90,P17-111,不仅果柄强度较高,荚果自植株上脱离时较少带有果柄,荚果和籽仁产量均比对照品种花育33号增产,品质性状优异。本研究为筛选和培育适宜机械化收获的花生品系提供理论基础。     

花生AhGPAT9与AhLPAAT4基因的原核表达及Western Blot分析

酰基转移酶基因家族是甘油三酯合成的关键基因。本研究以前期克隆的AhGPAT9与AhLPAAT4基因部分序列设计引物,构建原核表达载体,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,重组蛋白在37℃,5h诱导条件下获得高效表达。重组蛋白经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比较高的多克隆抗体。通过对重组蛋白纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示在纯化样品相应位置有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性。并采用制备的抗体对AhGPAT9与AhLPAAT4蛋白在花生不同组织及种子不同发育时期的表达进行了Western Blot分析。为深入研究AhGPAT9与AhLPAAT4基因的功能提供了科学数据。     

花生鞘脂Δ8去饱和酶基因(AhSLD2)的克隆与表达分析

本研究从花生中分离得到了1个AhSLD基因,命名为AhSLD2,该基因开放阅读框(ORF)为1347bp,编码448个氨基酸。AhSLD2蛋白与拟南芥AtSLD的相似性为73%,都具有b5保守结构域和3个组氨酸保守域结构,属于SLD蛋白家族。利用荧光定量PCR对AhSLD2基因在花生中的表达特性进行分析,结果显示AhSLD2主要在茎中表达,并且在种子发育初期表达量最高,AhSLD2基因对干旱和ABA胁迫最敏感,在根中的表达量分别上调了21倍和14倍,推测其可能主要参与花生对干旱胁迫的适应性调节。研究为花生抗逆品种改良提供了新的基因资源。     

92个花生品种(系)的果柄和荚果力学特性研究

花生果柄和荚果力学特性影响着花生收获机作业质量指标。本研究对92个花生品种(系)鲜荚果的果柄强度、荚果压缩破壳力、荚果层厚度和高度、产量和品质等指标进行测定和分析。34个品种(系)在荚果处脱落率为100%。大多数品种(系)的果柄强度在未熟和成熟荚果间差异不显著,秧-柄节点的果柄强度大于果-柄节点,荚果侧压破壳力正压立压。果柄强度均值与不同成熟度的果柄强度、秧-柄节点的果柄强度、果-柄节点果柄强度、荚果处脱落的百分率有一定的相关关系。3个方向的破壳力之间,荚果层厚度与荚果层高度之间,夹持状态荚果层厚度与荚果层厚度、夹持状态荚果层高度之间也存在一定的相关关系。筛选出了10个适于机械化收获的优质大花生品种(系),果柄强度较高,荚果和籽仁产量均比对照品种花育33号增产。为培育筛选适宜机械化收获的花生品种提供了参考。     

三个花生二酰甘油酰基转移酶基因的克隆与序列分析

二酰甘油酰基转移酶在植物油脂合成途径中具有重要的作用。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了三个DGAT基因,分别命名为AhDGAT1-1、AhDGAT1-2和AhDGAT3-3。其中AhDGAT1-1全长为2020bp,ORF为1539bp,理论分子量为58.6036kD,理论等电点为8.83;AhDGAT1-2全长为2553bp,ORF为1581bp,理论分子量为60.6598kD,理论等电点为8.94;AhDGAT3-3全长为1377bp,ORF为1023bp,理论分子量为36.911kD,理论等电点为8.17。将这三个基因在GenBank上注册,注册号分别为KC736068,KC736069和KC736067。     

花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.本研究利用PCR方法扩增出了PEPC基因片段,并将其克隆到pMD18-T Simple载体,序列分析表明克隆片段的长度为728bp.将该PEPC基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S双元表达载体,构建了带PEPC反义基因的双元载体并进行花生的转化,目前已获得转基因植株,收获T1代种子.     

盐碱地种植高油酸花生品种(系)产量品质性状分析

培育和筛选适宜在盐碱地种植的花生品种,对盐碱地开发及提高土地利用率有重要意义。本研究对种植在滨州盐碱地的13个高油酸花生品系和1个普通油酸对照品种的产量和品质性状进行测定,发现5个花生品种(系)在盐碱地种植相对产量较高,分别为花育33号、P16-8、P16-7、P16-10和P16-41。此外,在盐碱地种植的品种(系)的含油量、油酸含量和油亚比值均有不同程度的降低。本研究为耐盐碱花生品种(系)的筛选提供了参考数据。     

钙肥、铁肥对长期连作花生土壤真菌群落结构的影响

连作障碍是目前制约我国花生产业可持续发展的突出问题。解析花生连作障碍的机制，可以为缓解或解除花生连作障碍提供理论基础与技术支持。为了探究钙肥与铁肥对花生连作土壤真菌群落分布的影响，通过采用高通量测序技术分析了土壤真菌群落结构。UPGMA分析表明，施钙肥和铁肥均能影响长期连作花生土壤的真菌群落结构，并且施加这两种元素肥料对长期连作土壤真菌群落结构的影响程度均要大于花生品种对其的影响。热图分析表明，与对照相比，钙肥与铁肥处理下花生连作土壤真菌群落结构在门和属水平上都存在显著差异。在门分类水平上，钙肥和铁肥处理的子囊菌门、毛霉门在两个花生品种种植土壤中丰度均显著提高，担子菌门则有所下降，壶菌门丰度在花育20号连作土壤中下降，在花育26号连作土壤中却显著提高，且钙肥的影响明显强于铁肥。在属分类水平上，钙肥、铁肥均能明显改变连作花生土壤中真菌群落结构组成，且钙肥能显著增加花生连作土壤中优势真菌的总体丰度，花育26号连作土壤中的增幅明显高于花育20号，而铁肥处理的花育26号连作土壤中的优势真菌相对丰度同样增加，在花育20号连作土壤中却略有降低。以上结果表明，钙、铁元素施用会影响连作花生土壤中的真菌...