牦牛ACTA1基因启动子区克隆、DNA甲基化与组织表达相关性分析

为了探究骨骼肌α肌动蛋白1(ACTA1)基因在肌肉和脂肪等6个组织中的甲基化状态及mRNA表达水平,以类乌齐牦牛、麦洼牦牛为研究对象,成功克隆了牦牛ACTA1基因启动子区序列,且采用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测ACTA1基因启动子区甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪组织中的mRNA表达水平。结果显示,牦牛ACTA1基因转录起始位点上游及第一外显子区部分序列总长为1 028 bp;BSP法分析发现肌肉组织DNA甲基化水平最低,脂肪组织甲基化率最高,其中,类乌齐牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为6.25%,6.88%,20.00%,16.25%,26.25%,29.38%,麦洼牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为5.00%,7.50%,18.13%,20.00%,26.25%,28.75%;ACTA1基因mRNA表达量在肾脏、肺脏、肝脏和脂肪均极显著低于臀大肌(P0.01),且显著低于心脏(P0.05),类乌齐牦牛和麦洼牦牛心脏mRNA表达量具有显著性差异(P0.05),类乌齐牦牛肺脏组织甲基化率显著低于麦洼牦牛(P0.05),其他各组织甲基化率和mRNA表达量差异均不显著(P0.05),各组织甲基化水平与ACTA1基因mRNA表达量呈极显著负相关(r=-0.797,P=0.002)。结果表明,ACTA1基因DNA甲基化模式对肌肉发育具有一定的调控作用,可为牦牛遗传育种表观遗传标记提供部分数据支持。     

牦牛CTGF基因克隆、蛋白功能及组织表达分析

为获得牦牛CTGF基因的CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,并研究该基因在肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌等组织中的mRNA表达水平.以类乌齐牦牛为研究对象,采取RT-PCR方法获得类乌齐牦牛CTGF基因CDS序列,荧光定量PCR(qPCR)方法检测该基因在其5个组织中的mRNA表达水平.结果显示:牦牛CTGF基因含2个CpG岛,开放阅读框长度为1050 bp(登录号:MT968972),可编码349个氨基酸,CTGF编码蛋白存在信号肽,为水溶性不稳定的表面蛋白,共存在21个磷酸化位点和7个糖基化位点,在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多,有3个完整的保守功能结构域.荧光定量结果显示,CTGF基因在类乌齐牦牛肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌组织中均有表达,且在肝脏中表达水平最高.旨在为CTGF基因在调控牦牛肌肉生长发育方面提供参考数据.     

西藏牛和三江牛大脑组织中低氧适应相关circRNAs的比较分析

旨在从circRNA层面加深哺乳动物对高原低氧环境适应性的认识,探索西藏牛和三江牛大脑组织中差异表达的circRNA及相关调控网络,为研究circRNA在西藏牛低氧适应性方面的分子调控机制奠定理论基础。本研究分别采集3头4.5岁健康、雌性西藏牛和三江牛的大脑组织作为试验样本,构建cDNA文库进行高通量测序,利用生物信息学方法对宿主基因进行GO和KEGG分析,预测差异表达circRNA下游靶向基因,构建circRNA-miRNA和circRNA-miRNA-mRNA可视化调控网络,辅以RNaseR酶抗性检测和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证测序数据的可靠性。结果,在西藏牛和三江牛的6个样本中,共筛选获得858个显著差异的circRNAs,其中上调表达394个,下调表达464个。其宿主基因共参与49个功能亚类,注释到31条显著富集的信号通路（P<0.05）,主要涉及MAPK信号通路、谷氨酸能突触、Rap1信号通路、磷脂酶D信号通路及cGMP-PKG信号通路等生物学过程。靶基因预测结果显示,350个上调和364个下调差异表达circRNAs分别靶向结合492和508个miRNAs。其中,miRNA靶点数最多的是novel_circ_017825和novel_circ_046762,说明这两个circRNAs可能在西藏牛脑功能调控方面发挥重要作用。circRNA-bta-miR-2284z-mRNA调控网络展示了bta-miR-2284z与circRNA、mRNA间的靶向关系,推测上述circRNAs可能通过充当bta-miR-2284z海绵的方式,间接影响西藏牛脑组织中相关靶向mRNA的表达水平。随机挑选6个circRNA进行RNaseR酶抗性试验和qRT-PCR验证,表达趋势与测序结果一致,说明所获得的circRNA为环状转录本。本研究利用高通量测序技术获得了西藏牛和三江牛大脑组织中circRNA的表达谱及信号通路,并初步构建了circRNA-miRNA-mRNA网络互作模型,为后续进一步探索circRNA参与西藏牛低氧适应性的生物学过程和分子功能,研究circRNA在大型哺乳动物低氧适应性方面的调控机制提供了可靠的数据支持。     

类乌齐牦牛全基因组RNA编辑位点预测及剖析

为揭示牦牛不同组织间受RNA编辑导致转录产物发生的差异变化,进而为牦牛的组织分化、系统遗传调控等研究提供候选基因。本研究以3头4.5岁类乌齐母牦牛的大脑、小脑、臀部脂肪以及肌肉组织作为试验材料,通过Illumina 4000测序平台对各组织表达产物进行扫描,利用SPRINT和JACUSA筛选差异的RNA编辑位点,分析RNA编辑位点的分类、注释以及变异风险评估等。结果发现了总计24 784个RNA编辑位点,其中在4个组织中均发现存在编辑事件的有4 015个位点;4个组织中的RNA编辑位点主要以A-G和T-C编辑类型为主;发现其中一个高风险编辑位点位于SON基因中,使该基因的翻译提前终止,这将导致该组织一些特定位点的RNA与DNA结合出现问题。本研究预测并分析了类乌齐牦牛大、小脑和臀部肌肉、脂肪组织中RNA编辑差异位点的类型和分布,为进一步研究牦牛组织分化和生长发育中重要的调控基因提供了新的参考。     

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase,HSL）基因在牦牛中的遗传多态性,进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性,同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据,寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在3种基因型;②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余多态位点均偏离;③测序分析表明,H-FABP基因外显子4第7 339位（与原序列相比）发生单碱基突变（T→C）,该突变属同义突变;HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换,以及第6816处发生碱基A→G突变,并导致编码氨基酸由天冬氨酸（D）转变为甘氨酸（G）;外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变,编码氨基酸由半胱氨酸（C）变为甘氨酸（G）;④对各标记基因型生长发育指标（体高、体斜长、胸围、管围、体重）进行差异显著性检验,仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著（P﹤0.01）。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性,且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。     

麦洼牦牛MC4R基因多态性及与生长性状的相关分析

为探究黑皮质素4受体基因(MC4R)在麦洼牦牛群体中的遗传多态性,开展其与生长性状间的关联分析,采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对100头麦洼牦牛MC4R基因外显子区域进行多态性分析,并运用最小二乘方差分析法,对各基因型间体高、体质量、体斜长、胸围、管围等生长性状指标进行差异显著性检验。结果表明:MC4R基因引物P6上存在EE和EF 2种基因型,其中,粉嘴群只有EF基因型,存在严重偏态,EF型在2个群体中占绝对优势,E等位基因为优势基因;2个群体均处于中度多态(0.25相似文献   

牦牛GPR41基因遗传多态性与生长性状关联性研究

本研究旨在探讨G蛋白偶联受体41(GPR41)基因在牦牛中的遗传多态性,对麦洼牦牛(50头)、申扎牦牛(47头)和类乌齐牦牛(28头)GPR41基因外显子区域片段进行扩增,筛查SNPs位点,利用RFLP分子标记技术鉴定其基因型,开展其与生长性状间的关联分析,为牦牛品种改良和选育提供遗传学依据。结果表明:在麦洼牦牛中未发现突变位点,申扎和类乌齐牦牛在外显子2区域发现1个突变位点,第4570位碱基发生G→A突变,属同义突变;经RFLP鉴定出3种基因型,命名为AA、AG和GG;χ~2适应性检验显示,申扎牦牛基因型分布不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.01),类乌齐牦牛处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);申扎牦牛和类乌齐牦牛均表现为中度多态;GPR41基因不同基因型与申扎牦牛体重和体高显著相关,且GG型显著高于AA型(P<0.05),而GPR41基因不同基因型对类乌齐牦牛各体尺性状无显著性影响(P>0.05)。综上,申扎牦牛GPR41基因G4570A基因座可为牦牛选育过程中分子标记选择提供参考。     

类乌齐牦牛SIRT3基因克隆与生物信息学及差异表达分析

本实验旨在丰富牦牛 SIRT3基因的基础研究,通过对西藏类乌齐牦牛 SIRT3基因克隆、生物信息学分析及差异表达分析,进一步探讨 SIRT3基因的生理功能及分子机制。结果表明:类乌齐牦牛 SIRT3基因CDS区长 1 002 bp,编码 333个氨基酸,与普通牛 SIRT3基因 CDS区比对存在碱基突变,编码氨基酸发生错义和同义突变,同义突变发生在碱基第 49、279、342、384 位,错义突变发生在碱基第 149 和 620 位,其编码蛋白属亲水性蛋白,有多个跨膜区域和磷酸化位点,无信号肽片段,主要位于线粒体,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主;SIRT3基因编码蛋白在催化活性、核苷酸结合及辅因子结合等过程发挥主要功能,主要参与生物体代谢过程;类乌齐牦牛 SIRT3基因序列与普通牛一致性较高,亲缘关系最近;QPCR分析显示,SIRT3基因在牦牛肝脏中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。     

牦牛不同年龄肌肉组织microRNA表达谱及生物信息学分析

旨在挖掘牦牛不同年龄肌肉组织中miRNA表达谱,分析其生物学特征,以探索其在牦牛肌肉发育过程中的调节模式。本研究构建0.5、2.5、4.5和7.5岁肌肉组织的4个小RNA文库,利用Solexa技术进行测序,用生物信息学方法和RT-qPCR技术对测序结果进行分析和验证。结果,获得各miRNAs分别在4个年龄段肌肉组织中的表达量,在7.5岁肌肉组织中发现58个共同与0.5、2.5、4.5岁差异表达的miRNAs,其中53个miRNAs在7.5岁肌肉组织中显著下调,5个显著上调。运用R语言进行GO富集和KEGG信号通路分析,58个miRNAs可能通过PI3K-Akt、MAPK、Ras和肌动蛋白细胞骨架调节通路(regulation of actin cytoskeleton)参与调节牦牛肌肉细胞的增殖与分化,且PI3K-Akt、MAPK、Ras 3个信号通路共同靶向53个靶基因,说明3个信号通路相互关联。随机选择8个miRNAs进行RT-qPCR验证,结果表明其中7个miRNAs的表达趋势与测序结果一致。结果表明,牦牛肌肉发育可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,有助于构建肌肉组织中miRNA的调控网络,为进一步研究miRNA调控哺乳动物肌肉发育奠定了理论基础。