高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

蛋白质相互作用技术在热带植物病毒研究中的应用

蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction)承载着生物体生命活动的各个过程,研究热带植物病毒中的蛋白质-蛋白质相互作用,不仅可以从分子水平揭示病毒蛋白质的功能,还可以揭示病毒在寄主细胞中的侵染机理,从而制定相关策略预防病毒的突然爆发或进行疾病治疗。而蛋白质相互作用研究方法已有50多年的历史,如早期的化学交联法;并且该方法的技术在不断地完善和更新,产生了一序列新的技术,包括酵母双杂交、GST pull-down,免疫共沉淀和串联亲和纯化等多种技术。由于本实验室在热带植物病毒研究中涉及了多种蛋白质相互作用技术,为此,本文总结热带植物病毒研究中常用的蛋白质相互作用技术。     

辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定（ID-ELISA）,效价高达1 ∶ 125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1 ∶ 5 000~1 ∶ 25 000之间。     

酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

 香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuest^TM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

海南蔗区甘蔗害虫发生情况及防治对策

通过一年对海南甘蔗产区9个县(市)30个乡镇进行害虫调查,发现海南甘蔗害虫共有7目36科58种,其中蜚蠊目1科1种,等翅目1科1种,直翅目5科12种,缨翅目1科1种,半翅目11科14种,鞘翅目8科14种,鳞翅目9科15种。木蠹蛾、条螟、蔗根锯天牛、蔗根象、红尾白螟和异岐蔗蝗对海南甘蔗生产具有潜在威胁的害虫种类。总结了甘蔗苗期、生长中期及后期对各类害虫的防治对策,对指导海南蔗区甘蔗生产具有重要意义。     

南繁硅谷建设分析与思考

建成南繁硅谷是习总书记对南繁工作的重要指示。全面分析了南繁硅谷战略意义与独特作用，总结了国家南繁科研育种基地建设取得的成效、主要工作进展，同时也指出了科技创新支撑南繁种业发展动力不足、科研条件和科研平台有待整合提升、南繁公共科研服务条件尚待完善等问题。在实施创新驱动发展战略、建设创新型国家的背景下，提出了把南繁种业科技创新中心建设成为南繁硅谷的基本建设思路，制定了使其成为南繁科技创新的火车头、人才培养的孵化器以及种业国际化助推器的发展目标，提出了打造一个中心、三个基地、九个平台的建设任务，总结出了通过组织保障、资金保障、人才保障、基本建设保障等4项保障措施来加强南繁硅谷建设的建议。     

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物（ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC）的基因组。分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9717个核苷酸（nt）序列（GenBank登录号：GQ981316）。在核苷酸序列的第164位～第9270位存在一个大的开放阅读框（ORF）,编码一个多聚蛋白（分子量为350.44kD）。近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF（pretty interesting potyviridae ORF,PIPO）存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2892位～第3110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽（分子量为8.26kD）。ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率。本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位。     

MicroRNA用于创制抗PRSV番木瓜新种质的展望

微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物体内调控基因表达的一类非常重要的小分子RNA,在植物逆境适应过程中发挥着重要的作用。总结番木瓜环斑病毒(papaya ring spot virus,PRSV)致病机理研究的最新进展,探讨miRNA在植物抗病毒中的研究进展和应用前景,提出研究番木瓜miRNA参与抗PRSV机制的途径,为开展番木瓜miRNA研究和创制抗PRSV番木瓜新种质提供理论参考。     

黄瓜花叶病毒NASBA检测技术的建立

 以香蕉花叶病病样为材料,初步建立了黄瓜花叶病毒核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence based amplifica-tion,NASBA)的检测技术。通过以香蕉叶片总RNA为模板,在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)亚组ⅠRNA 2高保守区设计特异引物,进行NASBA反应,经5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品中出现了预期大小为310 bp的条带,而阴性和空白对照中均未出现。并对11份香蕉样品分别进行NASBA反应,并经过斑点杂交验证与RT-PCR检测比较,两者的检测结果一致,灵敏度相当,检出限量可达100 pg。