军曹鱼消化系统的形态及组织学研究

利用活体解剖和光镜技术对军曹鱼Rachycentron canadum消化系统进行形态及组织学研究。结果显示，军曹鱼消化道由口咽腔、食道、胃、幽门盲囊、前肠、中肠和后肠几部分组成。口咽腔大，粘膜上皮为复层鳞状上皮，内含少量杯状细胞。食道很短，但上皮包括复层鳞状上皮区和单层柱状上皮区。胃膨大，呈Y形，在贵门和幽门部可观测到杯状细胞，胃体粘膜层下有大量的胃腺细胞。幽门盲囊发达，肠短但分3部分，前肠、中肠和后肠，肠道系数为0．43，肠道由前向后杯状细胞和粘膜皱褶不断减少。消化腺包括肝脏和胰腺，肝小叶分界不明显，肝细胞内脂肪含量丰富，胰腺属于散在性的，其外分泌部有许多腺泡组成，胰岛分散于外分泌部间。     

军曹鱼稚鱼外周血细胞及其形态学观察

以出膜后第60天的军曹鱼外周血液为材料,利用光镜显微技术研究了其血细胞的种类和形态。外周血液包括5种类型的血细胞,红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和血栓细胞。血细胞计数测得红细胞密度为(2.97±0.82)×109ind.mL-1,白细胞密度为(1.39±0.94)×106ind.mL-1,淋巴细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血栓细胞在白细胞中所占的比例分别为(53.00±8.51)%、(17.59±4.28)%、(4.78±1.37)%和(24.63±4.08)%。未见到嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。血细胞计数结果表明,红细胞数量远远大于白细胞,白细胞中淋巴细胞数量最多,单核细胞数量最少。实验还观察到处于分裂状态的红细胞、细胞表面有伪足样胞突的小淋巴细胞和细胞表面有许多微绒毛突起的大淋巴细胞、核呈多种形态的单核细胞和中性粒细胞及不同形态的血栓细胞等。     

杂色鲍Fosmid基因组文库构建与血蓝蛋白基因筛选

以杂色鲍Haliotis diversicolor肌肉组织为材料,按照CopyControlTM Fosmid Library Production Kit中方法构建了杂色鲍Fosmid全基因组文库.从文库中随机挑取50个克隆进行NotⅠ酶切鉴定发现,阳性率达到100%,插入片段大小分布在32～48 kb之间,平均长度约37.6 kb.随机挑取8个克隆进行正、反向末端测序,获得了全部16个测序结果,其中8条序列确定为鲍来源基因序列.进一步根据杂色鲍血蓝蛋白(Hemocyanin)基因3’端序列设计特异引物,用PCR方法对基因组文库进行筛选,获得一个阳性克隆,经Primer-Walking测序、Blast比对和进化分析证实,该序列为杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型基因克隆.     

基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法的建立及应用

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)作为罗非鱼主要病原,传染力强、致死率高,部分鱼从发病到死亡无明显病症,难以确定鱼体是否携带该病原菌,建立适用于生产一线的无乳链球菌检测技术势在必行。根据GenBank中无乳链球菌透明质酸酶基因(hylB)、青霉素结合蛋白基因(pon A)和CAMP因子基因(cfb)的保守序列,设计3对特异性引物,对多重PCR的反应条件和体系进行优化,建立基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法,并运用该方法检测来自广东省不同地区的罗非鱼组织样品。构建的三重PCR检测方法仅在无乳链球菌中扩增出3条特异性条带,而在罗非鱼和常见的水产病原菌菌株中均未扩增出任何条带,表现出良好的特异性;以无乳链球菌基因组DNA浓度7.24×10~(–5)~5.65 ng/μl为模板进行扩增,该三重PCR能检测到的最低模板浓度为1.81×10~(–3) ng/μl,表现出较高的灵敏度;运用该方法检测188个罗非鱼组织样品,其阳性检出率与常规细菌分离鉴定阳性率一致,以常规细菌分离鉴定为标准,对该三重PCR检测方法进行评价,其诊断敏感性(Dse)和诊断特异性(Dsp)均为100%。结果表明,构建的三重PCR检测方法不仅显著提高了检测的准确度和灵敏度,还可在同一反应中同时检测3种无乳链球菌毒力基因,为无公害水产品中无乳链球菌的快速检疫、水产养殖病害早期预警提供了一种快速、精准和高效的检测技术。     

诺卡氏菌mce1A基因的克隆及重组表达

诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是近年来海淡水养殖鱼类频发慢性传染病的病原菌。该研究通过引物扩增得到全长1 254 bp、编码417个氨基酸的诺卡氏菌毒力因子mce1A基因的全序列。该基因编码蛋白质的分子量约为43.98 k D,理论等电点5.14,含有161个疏水性氨基酸,疏水性平均值为0.044,为疏水性蛋白,具有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种结构。经预测,Mce1A有MCE、DUF3407区域、OM_asym_Mla D、Mtu_fam_mce、Mla D 5个结构域,彼此交叠,含有公共区域。根据Mce1A氨基酸构建的系统进化树可以发现诺卡氏菌和新星诺卡氏菌的亲缘关系最近。构建p ET32a-mce1A重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21中,得到的重组蛋白的相对分子量约63 k D。温度、IPTG浓度对重组蛋白表达量没有影响。该研究为进一步研究Mce1A的致病机制奠定了基础。     

饲料中添加半乳低聚糖对军曹鱼生长、部分血清免疫和生化因子的影响

以添加0、0．2％、0．4％、0．8％和1．6％半乳低聚糖（GOS）的饲料投喂军曹鱼（Rachycentron canadum）8周，研究GOS对军曹鱼生长、部分血清免疫和生化因子的影响。当饲料中GOS的添加水平低于0．4％时能促进军曹鱼生长，但影响不显著（P〉0．05）。在饲料中添加适当水平的GOS对军曹鱼血清溶菌酶和超氧化物歧化酶（SOD）活性有显著的促进作用，而对过氧化氢酶（CAT）活性有显著的抑制作用。GOS对军曹鱼血清生化因子如总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素和直接胆红素的浓度有显著影响，对间接胆红素的影响不显著；只有GOS为0．2％的试验组血清总胆固醇浓度显著高于对照组，而0．4％的试验组血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）浓度显著低于对照组；当添加量低于0．8％时，碱性磷酸酶（AKP）活性随饲料中GOS含量增加而降低。结果表明，在饲料中添加适当水平的GOS有利于军曹鱼的生长，并且能够改善军曹鱼的免疫功能和健康状况，其最佳添加量为0．2％～0．4％。     

杂色鲍肌肉萎缩症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

近几年中国南方杂色鲍（Haliotis diversicolorReeve）养殖场频繁爆发严重的肌肉萎缩症,该病能感染各种规格杂色鲍,死亡率很高。病鲍症状主要表现为外套膜和内脏团萎缩、无生气,附着力下降,最终死亡。该试验从病鲍组织分离到1株优势菌WS,人工感染试验证实其对健康杂色鲍有很强致病性,且与自然发病的杂色鲍症状相同。对菌株WS进行形态学观察和生理生化检测,结果显示与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）最为接近。为了进一步确定其分类地位,采用1对通用引物扩增其16S rDNA序列片断进行序列分析和同源性对比,构建系统发育树,结果表明,菌株WS与弧菌属的V.harveyi[AY750577]聚为1个分支,且同源性达99.70%。综合上述3种鉴定结果,确定该菌为哈维氏弧菌。     

急性盐度胁迫下军曹鱼稚鱼应激反应的血清学指标

军曹鱼Rachycentron canadum稚鱼[体质量(25.6±4.9)g]从盐度37‰的自然海水中直接转移至盐度为0、5‰、15‰、25‰、37‰(对照)和45‰的水体中进行盐度急性胁迫试验,转移前及转移后0.5、1、2、3、6和12 h分别检测血清中皮质醇、血糖、乳酸和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等应激指标变化.结果显示,试验期间对照组各指标在基础值附近变幅平稳;盐度0组在6～12 h内出现100%死亡,且死亡前稚鱼皮质醇(256.7 ng·mL-1)和血糖(11.95 mmol·L-1)都显示显著高水平(P＜0.05),而乳酸和AST水平则较低;其他4个胁迫组在最初3 h内皮质醇、血糖和乳酸水平都出现不同程度升高,其中盐度25‰组变幅显著高于其他组,除盐度5‰组皮质醇和乳酸水平在后期有升高趋势外,各组3 h后都逐渐回落至基础值或对照组附近.血清AST水平前期变化较复杂,试验后期盐度5‰和25‰组水平显著高于其他3组.除在淡水中导致稚鱼死亡外,以皮质醇水平为主要应激指标,综合分析显示,稚鱼对盐度胁迫反应初期强弱依次为盐度25‰、5‰、15‰和45‰,而后期在盐度5‰下的应激强度又逐渐增强.     

牛蛙米尔伊丽莎白菌的分离、鉴定与特性分析

从广州番禺某养殖场患“歪头病”的牛蛙(Lithobates catesbeiana)体内脑组织中分离到1株致病菌MEYL-1. 对分离菌株采用细胞形态学、生化特性分析结合16S rDNA 和gyrB基因分子分析,判定所分离菌为米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）. 采用菌株MEYL-1人工回归感染,显示健康牛蛙注射1×10^8 CFU·mL-1的分离菌株可复制自然发病相似的“歪头”、“白内障”等症状,并且患病蛙中再分离到的致病菌与感染菌株相同. 综合理化特性分析、基因分子鉴定、回归感染实验可基本判定所患歪头病牛蛙病原为MEYL-1（米尔伊丽莎白菌）. 对19种常用药物敏感分析发现分离株MEYL-1对其中4种药物敏感,7种药物中度敏感,对另外8种药物耐受. 本研究通过对“歪头病”的牛蛙菌株的分离鉴定和药物敏感试验,明确了米尔伊丽莎白菌是引起其患病的病原,研究结果将为米尔伊丽莎白菌病的致病机制研究及牛蛙歪头病的防治提供参考依据.