稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因多位点编辑载体的构建

Pita2是定位于水稻第12号染色体着丝粒区域的稻瘟病广谱抗性基因,前期研究中通过精细定位得到了5个候选基因,其功能及作用原理还不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Pita2候选基因的多位点编辑载体。首先在候选基因外显子区域找到2个含有PAM序列的特异性靶位点序列,并构建候选基因入门载体SK-gRNA,然后利用同尾酶将SK-gRNA重组载体上的目的片段gRNA酶切,采用一步法将2个gRNA连接到双元表达载体p C1300-Cas9。质粒PCR鉴定以及测序的结果表明,以上5个多位点编辑载体构建成功。后期通过遗传转化并鉴定候选基因表达量与抗病性之间的关系,为水稻稻瘟病抗性基因Pita2功能研究奠定基础。     

水稻OsV3IP2和OsV3IP3原核表达与鉴定

通过生物信息学分析确定OsV3IP2和OsV3IP3的可溶性肽段,获得可溶性的OsV3IP2和OsV3IP3外源表达蛋白质,将相应的编码区克隆于原核表达载体p ET32a中,进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白质。结果表明,利用生物信息学软件对蛋白质的二级结构进行预测,将OsV3IP2、OsV3IP3分别分为2个和4个部分。将其分别克隆到p ET32a后,采用0.2 mol/L IPTG在10、20、30℃诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,证明OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1表达的融合蛋白存在于上清液中,而OsV3IP 3-2、OsV3IP 3-3表达的融合蛋白存在于沉淀中,获得了OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1可溶性目的蛋白,为进一步体外验证OsVDAC3与OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基础。     

稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因双元载体的构建

为了验证Pi36候选基因的功能,利用长片段PCR(long-range PCR,LR-PCR)技术从Pi36基因的供体品种Q61中扩增了3个候选基因Pi36-1,Pi36-2,Pi36-3,长度分别为5.9 kb,9.6 kb和16.5 kb,电泳回收目的片段,将Pi36-1和Pi36-2分别克隆到双元载体pCAMBIA1300,而将Pi36-3克隆到双元载体pYLTAC27的AscI位点.为了将Pi36-3也克隆到具有高效转化效率的双元载体pCAMBIA1300中,首先在不改变pCAMBIA1300基本骨架的前提下,在其多克隆位点增加了AscI酶切位点,获得新载体pCAMBIA1300AscI;然后将克隆在载体pYLTAC27上的Pi36-3片段切下来,组装到新载体pCAMBI-A1300AscI上.经过酶切鉴定和测序分析,已成功地获得了3个候选基因的重组阳性克隆,为进一步地研究Pi36基因的功能奠定了基础.     

紫外分光光度法测定过氧化氢酶的活性

过氧化氢酶的活性常作为植物代谢强度及抗寒抗病能力强弱的一个生理指标,其测定方法常用碘量滴定法。该法重现性较差,误差大,延续时间长,尤其在大量样品的分析过程中工作量就更大。为了克服碘量法的不足,作者对经典碘量法进行了改进,即用紫外分光光度法代替硫酸钠滴定游离的碘。结果表明,新改进的方法测出的数据较稳定可靠。     

紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究

营养缺陷型是一种生化突变株,它的出现是由基因突变引起的。营养缺陷型菌株在遗传学、食品生物技术、微生物代谢等领域的研究中均具有重要作用,另外它还是研究基因的结构与功能的常用材料。该研究以大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α为实验材料,利用紫外线(UV)对其进行诱变,并且采用青霉素法浓缩营养缺陷型细菌,采用逐个测定法检出营养缺陷型,利用生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定、分析,得到了4株稳定的营养缺陷型突变株,分别为赖氨酸、组氨酸、精氨酸和嘧啶营养缺陷型菌株。     

鄂西地区稻瘟病菌生理小种文库的构建及初步鉴定

[目的]构建鄂西地区的稻瘟病菌文库,并对其进行初步的鉴定分析。[方法]从鄂西地区7个水稻主产区不同的水稻品种上收集稻瘟病感病稻秆,进行分离、纯化和菌落形态的初步鉴定分析,并利用RAPD和REMAP分子标记对该文库进行聚类分析。[结果]建立了含有52种菌株的稻瘟病菌生理小种文库;聚类分析结果表明,鄂西地区的稻瘟病菌群体结构呈现多样性和复杂性,遗传谱系与菌落形态之间并不存在简单的一一对应关系。[结论]该研究为预测鄂西地区病原菌群体的变化趋势以及水稻抗病品种的选育,奠定了基础。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化(英文)

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5 (Rf1b5 ),装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978 bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达

水稻Os SSI2基因负调控水稻的抗病反应,为了研究该基因的抗性机理,构建p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞后利用IPTG诱导外源蛋白表达并优化表达条件,使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。结果表明:成功构建了p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体后进行原核表达,在IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为25℃,诱导表达7 h,通过SDS-PAGE和Western Blot检测发现Os SSI2蛋白的可溶性表达量最多,为进一步研究水稻Os SSI2蛋白的抗性机理奠定了基础。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16 h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30 d的植株中,转-220～0 bp片段的GUS染色最少,转-524～0 bp及-468～0 bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0 bp和-468～0 bp 2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1 150～0、-800～0、-220～0 bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（South-ern杂交结果）;-800～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1 150～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220 bp存在提高启动子活性调控元件,-1 150～-524 bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。