水牛甲状旁腺素1受体基因CDS区克隆与生物信息学分析

试验旨在对水牛甲状旁腺素1受体（parathyroid hormone 1 receptor,PTH1R）基因CDS区进行克隆,并对所获序列进行生物信息学分析,以期丰富水牛PTH1R基因研究的基础数据。提取水牛基因组DNA,以牛PTH1R基因为参考序列（GenBank登录号：NM_001075332.1）,应用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,运用PCR扩增及测序获得水牛完整CDS区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORT Ⅱ Prediction等在线分析软件分析PTH1R的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树。结果显示,试验成功克隆了水牛PTH1R基因完整编码序列,该序列长为2 283 bp,CDS区长1 770 bp,序列已提交GenBank,登录号：MF380401,可编码589个氨基酸。PTH1R基因CDS区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼同源性比对结果显示,其同源性分别为99.4%、93.2%、93.5%、95.3%、98.1%和93.9%,物种之间同源性较高,进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTH1R基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTH1R蛋白分子式为C₂₉₉₆H₄₆₁₆N₇₉₂O₈₂₃S₃₀,分子质量为65 860.22 u,半衰期为30 h,理论等电点（pI）为8.37,水溶液在280 nm处的消光系数为117 770,肽链N端为M（Met）,不稳定系数为43.36,属于碱性不稳定蛋白。脂肪系数为88.61,总平均亲水性为0.007,该蛋白属于不可溶性蛋白。二级结构分析显示,水牛PTH1R基因蛋白中包含有218个α-螺旋、114个延伸链、44个β-转角、213个无规则卷曲,与三级结构预测结果相一致。综上所述,PTH1R基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性,PTH1R基因的成功克隆及分析为进一步揭示其遗传特性提供了理论依据。     

沼泽型水牛微卫星DNA的遗传多样性分析

为探究中国沼泽型水牛品种或类群的遗传多样性,本研究采用了沼泽型水牛30个微卫星标记结合LabChip芯片检测法对德昌水牛、德宏水牛、温州水牛、贵州水牛、西林水牛、富钟水牛及两个引进品种摩拉水牛、尼里－拉菲水牛等40个样本进行了检测和遗传多样性分析。结果表明,在30个微卫星DNA标记上共发现332个等位基因,平均基因多样性和PIC值分别为0.7808和0.7554。聚类分析结果显示,德宏水牛和德昌水牛先聚为一类,随后与富钟水牛、贵州水牛、温州水牛、西林水牛聚为一类;摩拉水牛与尼里－拉菲水牛聚为一类。本研究证实了所选的30个沼泽型水牛微卫星DNA标记可作为有效的遗传标记用于水牛品种间的遗传多样性分析,同时也丰富了当前的水牛微卫星标记资源。     

抑制BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测Smad4基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选的干扰效率最高的siRNA,转染水牛卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测对照组和干扰组细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测上述两组细胞凋亡相关基因Bax和Bcl2,细胞周期相关调控基因CyclinD2和CDK4,以及类固醇激素合成相关基因Cyp19A1和Cyp11A1的表达水平,并通过ELISA检测雌二醇(E₂)和孕酮(P₄)的含量。【结果】基因干扰试验结果表明,3对siRNAs对Smad4基因的表达均具有极显著的干扰作用(P<0.01),其中Smad4-siRNA1的干扰效率最高,达到了64%。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,干扰组细胞的增殖效率显著降低(P&l...     

水牛甲状旁腺素1受体基因CDS区克隆与生物信息学分析

试验旨在对水牛甲状旁腺素1受体(parathyroid hormone 1receptor,PTH1R)基因CDS区进行克隆,并对所获序列进行生物信息学分析,以期丰富水牛PTH1R基因研究的基础数据。提取水牛基因组DNA,以牛PTH1R基因为参考序列(GenBank登录号:NM-001075332.1),应用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,运用PCR扩增及测序获得水牛完整CDS区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORTⅡPrediction等在线分析软件分析PTH1R的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树。结果显示,试验成功克隆了水牛PTH1R基因完整编码序列,该序列长为2 283bp,CDS区长1 770bp,序列已提交GenBank,登录号:MF380401,可编码589个氨基酸。PTH1R基因CDS区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼同源性比对结果显示,其同源性分别为99.4%、93.2%、93.5%、95.3%、98.1%和93.9%,物种之间同源性较高,进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTH1R基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTH1R蛋白分子式为C2996H4616N792O823S30,分子质量为65 860.22u,半衰期为30h,理论等电点(pI)为8.37,水溶液在280nm处的消光系数为117 770,肽链N端为M(Met),不稳定系数为43.36,属于碱性不稳定蛋白。脂肪系数为88.61,总平均亲水性为0.007,该蛋白属于不可溶性蛋白。二级结构分析显示,水牛PTH1R基因蛋白中包含有218个α-螺旋、114个延伸链、44个β-转角、213个无规则卷曲,与三级结构预测结果相一致。综上所述,PTH1R基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性,PTH1R基因的成功克隆及分析为进一步揭示其遗传特性提供了理论依据。     

水牛LPIN1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆获得水牛脂素1(LPIN1)基因,并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛脂肪沉积、生殖发育和泌乳调控中的作用奠定基础。本研究以水牛卵巢组织cDNA为模板,PCR扩增获得了LPIN1基因CDS区全长后测序,并结合生物信息学分析方法预测及分析蛋白质理化性质、二级结构及三级结构等。结果表明,水牛LPIN1基因编码区长2 793bp,编码930个氨基酸。MegAlign软件分析显示,水牛LPIN1基因核苷酸序列与水牛(预测)、牦牛、黄牛、山羊、藏羚羊、绵羊、猪、骆驼、人和小鼠LPIN1基因的同源性分别为99.6%、97.9%、97.7%、97.5%、97.4%、97.1%、89.9%、89.8%、86.2%和83.5%;水牛lipin1蛋白氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、藏羚羊、骆驼、猪及人的同源性分别为99%、99%、99%、99%、94%、94%及90%。应用Mega 5.0软件构建系统进化树发现,水牛与黄牛的亲缘关系最近,其次为绵羊和山羊,LPIN1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。对lipin1蛋白分析发现,其二级结构由α-螺旋、β-折叠、T-转角和无规则卷曲组成;蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚细胞主要定位于细胞核中,存在Lipin_N、LNS2和AF1Q等结构域,其中Lipin_N、LNS2为保守结构域。     

水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素，并预测其转录结合因子，为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板，PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列，并定向克隆至pGL3-promoter载体；将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞，通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性，并探究其与促黄体素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）的关系；利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示，本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段，并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现，pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强，证实－866/－1 500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域，表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示，添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现，HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点：Sp1（－2 327/－2 317 bp）、HOXA4（－2 162/－2 146 bp）、Sp1（－1 409/－1 395 bp）、Sp1（－1 391/－1 380 bp）、Sp1（－1 345/－1 319 bp）和GATA1（－812/－801 bp），但无CpG岛，有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体，确定了HSD17B1基因启动子核心区域，并证明LH可增强启动子活性。     

飞行时间质谱法检测水牛黑素皮质素受体4基因多态性

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)检测水牛黑素皮质素受体4(MC4R)基因的多态性(SNPs),为今后建立水牛辅助标记选择策略奠定基础。以水牛MC4R基因序列为模板,利用PCR扩增测序法筛查了水牛MC4R基因13个SNPs。为进一步验证筛选的可靠性,应用MALDI-TOF-MS针对380头水牛检测了8个标记的基因型。结果显示,平均检出率为98.0%,能够准确的检测出3种常见的基因型。所检SNP位点的平均最小等位基因频率(MAF)为0.24,平均杂合度为0.28,平均多态信息含量(PIC)为0.23。本研究建立的基于PCR测序法联合MALDI-TOF-MS检测水牛MC4R基因多态性的方法,具有快速、可靠和准确的特点,为今后开展水牛生产性状基因的SNP分型和检测等研究奠定了基础。     

水牛浮舰蛋白2基因克隆及序列分析

试验旨在克隆水牛浮舰蛋白2(Flotillin 2,FLOT2)基因并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛发育繁殖中的作用奠定基础。本研究通过PCR扩增获得了FLOT2基因全长并进行克隆测序,结合生物信息学分析方法,预测及分析其蛋白质结构。结果表明,水牛FLOT2基因编码区长1 287 bp,编码428个氨基酸,3'UTR区长277 bp。多重序列比较分析显示,水牛FLOT2基因核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、小鼠、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、98%、97%、90%、93%、92%和92%,系统进化树分析结果表明,FLOT2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对FLOT2蛋白质的分析表明,该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于细胞质中,存在SPFH_flotillin和SPFH_hflk等结构域。microRNA预测结果表明,bta-miR-2438、bta-miR-2379和bta-miR-1777a可能是其3'UTR潜在靶标。研究结果为今后阐明FLOT2基因在水牛繁殖性能中的功能,尤其是在配子及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了基础。     

水牛瘦素基因单核苷酸多态性分析

试验旨在检测水牛瘦素（Leptin）基因序列的多态性,为进一步开展水牛标记辅助育种研究奠定基础。运用DNA混合池结合直接测序及高分辨熔解曲线（HRM）法在182头奶水牛个体中进行Leptin基因SNP位点的筛选和分型。结果表明,在试验群体中Leptin基因共发现7个SNPs,位于内含子1、内含子3和外显子3区域,分别是A3123G、A3776G、A4154G、A5228G、A5524C、G5573T和A5751C。除了SNP5和SNP6位点在尼里－拉菲水牛群体中的多态信息含量（PIC）属于低度多态之外,所有SNPs位点在3个水牛群体中均属于中度多态。经χ²检验,所有SNPs位点的突变在尼里－拉菲水牛群体均达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。本研究成功筛查7个水牛Leptin基因SNPs位点并进行了基因分型,为下一步开展奶水牛Leptin基因的标记－性状关联分析奠定基础。