猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建了重组表达载体pPG-s1,将其电转化干酪乳杆菌L.casei 393,获得了表达PEDV S1蛋白的重组乳酸茵杆菌.重组杆菌诱导后,经western blot、间接ELISA实验表明,目的蛋白获得了分泌表达.将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后于不同时间分别测定了粪便中特异性的sIgA和血清中IgG;用MTT法检测免疫小鼠细胞脾淋巴细胞增殖情况.结果表明该重组干酪乳杆茵表达系统能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答,在肠道可产生分泌型Iga抗体,并可检测到高水平血清IgG;不仅能诱导体液免疫反应,还可诱导细胞免疫应答.表明所构建的重组干酪乳杆茵表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为探索新型猪流行性腹泻口服疫苗的研制奠定了基础.     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立

为建立绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据JSRV的ag基因,选取其保守序列作为检测目的片段,设计并合成相应的引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因构建重组质粒pMD-gag,并将其作为阳性标准品,梯度稀释建立标准曲线,得到扩增方程为:y=-0.304x+38.4,扩增效率为100％,线性相关系数为0.999,该方法最低检出量为103拷贝,与其它病原核酸样品无交叉反应,其变异系数在1.374％以内.本研究为快速检测JSRV以及组装检测试剂盒奠定了基础.     

猪传染性胃肠炎病毒纤突S蛋白干酪乳杆菌表达载体系统的构建

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR,获得含有TGEV S基因4个主要抗原位点的约2000 bp目的片段,将其分别与表达载体质粒pPG611.1和pPG612.1进行连接,通过电转化进入宿主菌Lacto-bacillus casei393细胞内,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析,表明TGEV S基因已成功插入到表达载体质粒中,获得了TGEV S蛋白干酪乳杆菌表达载体系统。     

中国林蛙皮肤抗菌活性肽的分离提取

将中国林蛙毁双髓,置冰浴中迅速剥皮,冲洗血污后粉碎,经80％甲醇抽提2次;再经sephadex G-100、sephadex G-25和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等,从林蛙皮肤中分离获得5种小分子多肽。抗菌活性试验表明：经sephadex G-25凝胶过滤获得的小分子多肽洗脱峰第6峰,对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性;SDS-PAGE电泳表明为单一区带,此抗菌活性多肽的相对分子量为4．31ku。     

长期不同施肥处理对连作玉米产量和土壤养分变化的影响

采用长期定位施肥方式,研究不同施肥处理对连作玉米产量和土壤养分变化的影响.结果表明,不同施肥处理对土壤全量养分影响顺序为OM>TS>NP>CK,对土壤pH的影响顺序为OM>CK >TS>NP,对土壤速效养分影响顺序OM>NP>TS>CK;不同施肥处理对产量的影响顺序为OM>NP>TS>CK.     

食源性致病菌基因组DNA的高效提取方法

研究高效提取食源性致病菌DNA的方法,以适用于变性高效液相色谱基因分型法的高通量快速检测.试验采用沸水浴法、酚/氯仿-CTAB法、chelex100法和酶解吸附膜法分别提取沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、肠出血性大肠杆菌O157∶ H7、创伤弧菌中主要的食源性致病菌基因组DNA.并对基因组DNA的纯度和产量进行测定,通过定性、定量分析,确定了适用于食源性致病菌快速检测的DNA提取方法--酶解吸附膜法.     

应用DNA环介导恒温扩增技术快速检测空肠弯曲菌

【目的】空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病致病菌,主要经被污染的水源、乳制品、生禽肉进行传播,建立快速、准确的诊断方法是防控空肠弯曲菌感染的重要措施。【方法】本文引入一种新型的核酸检测技术--DNA环介导恒温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP),以空肠弯曲菌ORF-C序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌LAMP快速检测方法。【结果】利用本LAMP方法对21种病原菌进行检测,仅空肠弯曲菌为阳性结果,说明该方法具有高度的特异性。该LAMP方法对空肠弯曲菌纯培养菌的检测灵敏度达6CFU/反应管,对污染材料中空肠弯曲菌的检测灵敏度为9CFU/反应管。【结论】本研究建立的空肠弯曲菌LAMP检测方法操作简便、检测快速,具有良好的实用性。      

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用。试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA/LR-CO21、含有空载体质粒的重组猪源罗伊氏乳杆菌pPG/LR-CO21和磷酸盐缓冲液(PBS)各4 mL,连续口服3 d,口服后观测时间为14 d。期间仔猪自由采食,记录各组仔猪体重变化和腹泻情况。试验2:选取30头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为5组,分别口服1、3、6、9、12 mL半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-7.50/mL的TGEV。设置7 d时间为观察期,分析半数致死量的条件。试验3:另选取1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪32头,随机分为4组,分别为重组菌组、空载菌组、对照组、TGEV感染组,每组8个重复,每个重复1头仔猪。试验组每天每头按照2×1010 CFU的剂量口服pPG-LFCA/LR-CO21、pPG/LR-CO21及等体积的PBS,连续口服饲喂1周,在8日龄按照半数致死量口服TGEV感染,感染7 d后进行样品采集。记录各组仔猪体重变化和腹泻情况;苏木精-伊红(HE)染色检测小肠绒毛高度及隐窝深度;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测仔猪血清中总免疫球蛋白G(IgG)和肠黏液总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)抗体含量;实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白相关基因封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Toll样受体2(TLR2)的mRNA相对表达量;对仔猪盲肠内容物进行菌群结构分析。结果表明:口服重组猪源罗伊氏乳酸杆菌后,与对照组相比,重组菌组新生仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01),而腹泻率降低且差异极显著(P<0.01);与TGEV感染组相比,重组菌组仔猪平均日增重增加且腹泻率降低,差异显著(P<0.05);空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的比值显著增加(P<0.05);仔猪血清中总IgG和肠黏液总sIgA抗体含量显著升高(P<0.05);肠黏膜组织中紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),血清中细胞因子TNF-α含量极显著降低(P<0.01),血清IFN-γ、IL-6、IL-8、TLR2含量极显著升高(P<0.01),仔猪存活率提高。对仔猪盲肠内容物进行菌群多样性分析结果显示,TGEV感染仔猪后肠道正常菌群占比下降,相比于TGEV感染组,口服重组菌的仔猪肠道菌群致病菌拟杆菌属占比下降,差异显著(P<0.05),菌群多样性更接近对照组,肠道菌群的代谢、遗传信息处理等功能均有所增强。综上所述,本试验成功构建了分泌表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌菌株,经口服途径饲喂新生仔猪后,能够促进仔猪生长,降低新生仔猪的腹泻率,经口服途径饲喂感染TGEV的新生仔猪后,可以改善肠道环境,降低病毒对仔猪肠道的损伤,对仔猪抗TGEV感染提供有效保护。