大豆查尔酮还原酶基因GmCHR的克隆与植物表达载体构建

黄酮类化合物在植物中参与过滤紫外线、固氮和花色形成等过程,异黄酮对人体有抗氧化、预防乳腺癌等保健作用。查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)是植物中参与黄酮类化合物代谢的重要酶。克隆大豆查尔酮还原酶基因并构建植物表达载体,有助于进一步研究其功能和异黄酮的代谢过程。采用RT-PCR方法,从栽培大豆(Gly-cine max)南农1138-2中,克隆得到了第14号染色体上的一个编码大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)的基因,命名为GmCHR。该基因含有948 bp长的编码区序列(Coding DNA Sequence,CDS),编码315个氨基酸。预测其蛋白质分子量为35.5 kDa,等电点为6.32。与其他豆科植物中的查尔酮还原酶相比,GmCHR蛋白序列与葛藤(Puerari-ae montana)CHR的相似性最高,达94%。组织表达分析表明,在自然生长条件下GmCHR在叶中的表达量最大;其次是种子;在花和茎中相同;在根中的表达量最小。利用Gateway方法获得植物过表达载体pMDC83-GmCHR,经检测表明过表达载体已成功转化农杆菌EHA105,为今后进一步了解GmCHR在大豆异黄酮代谢过程中的功能提供材料基础。     

大豆结荚习性、荚色和种皮色相关野生片段分析

结荚习性、荚色和种皮色是大豆的重要形态性状,与进化密切相关。利用由151个家系组成的野生大豆(Glycinne soja Sieb et Zucc.)染色体片段代换系(CSSL)群体(SojaCSSLP1),通过不同表型CSSL组间比对,分别检测到与结荚习性、荚色和种皮色相关的1个、3个和2个野生片段(基因)。其中,5个野生片段(基因)分别与前人在栽培豆中检测到的无限结荚Dt₁、荚色L₁、荚色L₂、绿种皮G和黑种皮i基因相对应,说明野生大豆与栽培大豆间、栽培大豆与栽培大豆间在这些片段上均存在等位变异分化,是与大豆进化相关的基因/片段。另一个与荚色相关的Satt273野生片段能使大豆表现黑荚,可能是本研究的新发现,但还需进一步验证。     

大豆重组自交系群体NJRSXG百粒重超亲分离的遗传解析

【目的】解析大豆重组自交系中百粒重的QTL及其等位变异效应,探究重组自交系中百粒重存在超亲分离的原因,为进一步培育不同类型百粒重大豆提供遗传依据。【方法】利用以先进2号和赶泰2-2为亲本衍生的重组自交系群体NJRSXG为材料,在2009-2011年共5种环境下测定百粒重表型数据,建立具有400个SSR标记的遗传图谱,选用QTLNetwork V2.1软件中混合模型区间作图方法（mixed model based composite interval mapping,MCIM）对表型数据和基因型数据进行大豆百粒重QTL定位研究。在定位结果基础上,分析每个重组自交系群体中每个家系百粒重QTL等位变异类型,建立百粒重QTL-allele矩阵。【结果】5种环境试验的平均结果,亲本先进2号和赶泰2-2的百粒重分别为16.92和14.14g,重组自交系百粒重变幅为12.09-25.01 g,存在超亲分离,多环境下遗传变异系数（genotypic coefficient of variation, GCV）为16.06%,遗传率为96.17%。利用MCIM方法联合5环境原始数据,总共检测到10个加性QTL和9对上位性QTL,10个加性QTL的表型变异解释率变幅为0.69%-14.93%,其中Sw-05-2、Sw-08-1、Sw-12-1和Sw-17-1的表型变异解释率较高,分别为6.91%、14.93%、7.80%和5.01%,Sw-13-3为以往未见报道并兼具加性和上位性效应的位点。上位性QTL的表型变异解释率较小,变幅为0.31%-3.44%,其中Sw-e4的表型变异解释率最高。联合多环境方差分析和QTL定位结果,解析大豆百粒重的遗传结构,发现加性QTL累积贡献了47.91%表型变异,上位性QTL累积贡献13.06%表型变异,未检测出的微效QTL累计解释了35.20%的表型变异。在定位的同时,获得了QTL等位变异的效应,分析重组自交系及其亲本中百粒重QTL等位变异的组成,建立了NJRSXG的百粒重QTL-allele矩阵;两亲本分别具有7对和3对加性增效等位变异,属互补型组合;矩阵中没有一个重组自交家系包含所有减效等位变异或增效等位变异,表明重组自交家系具有进一步改良的潜力;大粒型家系具有较多增效等位变异,小粒型家系具有较多减效等位变异;说明百粒重位点间的重组是产生超亲家系的重要原因。【结论】利用重组自交系群体能够产生超亲分离家系;联合多环境数据检测到10个加性QTL和9对上位性QTL;百粒重QTL位点间的重组是超亲分离的原因;重组自交家系间具有进一步重组的潜力。     

限制性两阶段多位点全基因组关联分析法在遗传育种中的应用

全基因组关联分析（genome-wide association studies,GWAS）通过建立全基因组高密度分子标记以检测基因型与表型间的关联性,已成为动植物数量性状遗传解析的主要方法。然而,以往GWAS方法只注重于个别主要QTL的检测,而且使用仅有2个等位变异的SNP标记不能检测自然群体中广泛存在的复等位变异,一定程度限制了GWAS的应用。限制性两阶段多位点全基因组关联分析方法（RTM-GWAS）首先根据全基因组高密度SNP标记间的连锁不平衡程度,将多个相邻且紧密连锁的SNP标记组成为具有复等位变异（单倍型）的连锁不平衡区段（SNPLDB）标记。其次,RTM-GWAS使用由SNPLDB标记计算的遗传相似系数矩阵作为群体结构偏差的通用估计,并提取该矩阵的特征向量作为模型协变量以降低由群体结构偏差导致的假阳性。最后,利用具有复等位变异的SNPLDB标记与建立的多位点复等位变异模型,RTM-GWAS将性状遗传率作为QTL表型变异解释率的上限,通过两阶段分析策略高效地进行全基因组QTL及其复等位变异的检测,并最终构建多QTL遗传模型。该法还可以基于性状小区观测值,建立QTL与环境互作多位点模型,不仅能检测与环境有交互作用的主效应QTL,还能检测仅与环境有交互作用的无主效应QTL。RTM-GWAS不仅解决了以往GWAS不能估计复等位变异的问题,而且通过使用多位点模型拟合多个QTL提高了检测功效并能有效地控制假阳性的膨胀,为全面解析自然群体QTL及其复等变异提供了通道。该法能估计出等位基因的效应及其在群体内的相对频率,由其结果建立的QTL-allele矩阵代表了目标性状在群体中的全部遗传组成,不仅可用于候选基因发掘,还为群体内QTL及其复等位变异（基因及其复等位基因）的动态研究（群体遗传分化以及特有与新生等位变异）提供了新的工具。依据QTL-allele矩阵,还能进一步利用计算机模拟产生杂交组合后代基因型,并预测杂交组合后代纯合群体的表现,从而进行优化组合设计与分子设计育种。此外,RTM-GWAS还适用于双亲杂交后代重组自交系群体以及多亲杂交后代巢式关联作图群体,因避免了群体结构偏离的干扰,检测功效更高。本文归纳了RTM-GWAS的原理和方法,并综述了其在遗传育种研究中的应用。     

中国野生大豆对斜纹夜蛾的抗生性鉴定及资源遴选

试验在前期对栽培大豆进行抗生性鉴定的基础上,2014和2015年在养虫室喂养斜纹夜蛾初孵幼虫,以喂养第6,9和12天幼虫重的隶属函数值为抗生性指标评价了来自我国各大豆生态区的200份代表性野生大豆种质资源的抗虫性。两年第6天结果的联合方差分析表明:材料间、年份间、材料与年份互作间差异均达极显著水平。2015年不同喂养期幼虫重的隶属函数值联合方差分析表明:材料间、喂养期间差异均达极显著水平,材料与喂养期间无明显互作。按标准品种分级法对供试材料进行分级,发现野生大豆抗生性与地理来源有关,长江中下游生态区(III)及西南-中南生态区(IV)的高抗材料较多,而北方生态区(I)的高感材料较多。从供试的野生大豆资源中筛选出高抗和高感材料各10份,高抗材料的抗性高于国际常用的栽培大豆抗源PI227687和Lamar,可用于后续的野生大豆抗虫鉴定、抗虫机理及抗虫育种等研究。     

大豆资源的筛豆龟蝽[Megacopta cribraria (Fabricius) ]抗性鉴定

在观察筛豆龟蝽发生情况及其在大豆上的危害特征基础上,比较了田间自然危害条件下各种抗性鉴定指标,以茎枝黑霉程度结合叶片紫斑数为抗性分级指标鉴定了国内外大批资源,筛选出58份抗、感食叶性害虫的大豆材料,其筛豆龟蝽抗性结果表明,品种间、观察日期间和区组间都有极显著差异,品种×观察日期互作也极显著,最终筛选出PI227687、安陆小黄豆、花柒黄毛豆、沔阳白毛豆等高抗种质,并提出了一套鉴定方法和指标。     

大豆地方品种叶片叶柄茸毛性状的形态变异及其与豆卷叶螟抗性的相关分析

大豆茎、叶、荚普遍着生茸毛,表现有末端形态、密度、长度和角度(着生状态)的差异.本文利用地方品种群体研究了大豆叶片和叶柄茸毛性状的变异、区域差异、相互关系及其与大豆对豆卷叶螟抗性的关系.大豆叶片茸毛密度、长度、角度和叶柄茸毛角度在全国393份代表性大豆地方品种间存在大幅度变异,变幅分别为4.8～105.9根·10 mm-2(无茸毛品种除外),0.22～0.94 mm,0°～88°和5°～90°.叶片茸毛密度、长度和角度大的品种较少,而叶柄茸毛角度小的品种较少.393份大豆地方品种中尖型茸毛末端品种127份.叶片茸毛长度、角度、末端形态及叶柄茸毛角度与地理生态区有关,生态区Ⅰ的叶片茸毛较长,生态区Ⅰ和Ⅱ的叶片茸毛角度较大,生态区Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的钝型茸毛末端比率较高,生态区Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ的叶柄茸毛角度较大,而叶片茸毛密度与生态区无关.叶柄、叶片茸毛角度及叶片茸毛长度间相互呈极显著正相关,叶片茸毛密度与长度间呈极显著负相关.叶片茸毛密度和长度在茸毛末端形态间也有显著差异,尖型茸毛末端的品种茸毛密度较大,长度较短.豆卷叶螟引起的虫包数和卷叶率与叶片、叶柄茸毛角度及叶片茸毛长度极显著正相关,而与叶片茸毛密度显著负相关,与茸毛末端形态无关.叶片茸毛角度与抗虫性指标相关性最强,角度越小越抗虫,是大豆抗豆卷叶螟的重要因子.     

中国野生大豆群体农艺加工性状与SSR关联分析和特异材料的遗传构成

选用204对SSR标记对全国野生大豆群体(174份代表性样本)的基因组扫描,采用TASSEL软件的GLM (general linear model)方法对百粒重、开花期、成熟期、干豆腐得率、干豆乳得率和耐淹性性状值关联分析,解析与性状关联位点的优异等位变异,鉴别出一批与农艺、加工性状关联的优异等位变异及携带优异等位变异的载体材料;进一步分析极值表型材料的遗传构成。结果表明: (1)累计51个位点(次)与性状关联,有些标记同时与2个或多个性状相关联,可能是性状相关的遗传基础;关联位点中累计16位点(次)与连锁分析定位的QTL一致;(2)与地方品种群体和育成品种群体的关联位点比较,发现野生群体关联位点只有少数与之相同,群体间育种性状的遗传结构有明显差异。(3)与多性状关联的位点其等位变异对不同性状的效应方向可相同可不同,如GMES5532a-A332对百粒重和耐淹性的相对死苗率都是增效效应,而GMES5532a-A344对百粒重是减效效应,对相对死苗率是增效效应;(4)极值表型材料间的遗传构成有很大差异。表型值大的材料携带较多增效效应大的位点等位变异,例如N23349的百粒重是9.08 g,含有4个增效效应较大的位点等位变异;表型值小的材料携带较多减效效应大的位点等位变异,如N23387的百粒重是0.75 g,含有4个减效效应较大的位点等位变异。关联作图得到的信息可以弥补连锁定位信息的不足,尤其是全基因组位点上复等位变异的信息为育种提供了亲本选配和后代等位条带辅助选择的依据。     

大豆抗筛豆龟蝽Megacota cribraria(Fabricius)的QTL分析

筛豆龟蝽是我国南方大豆的主要害虫之一,本研究旨在定位筛豆龟蝽抗性QTL,分析其稳定性,为大豆抗筛豆龟蝽育种提供参考.以科丰1号×南农1138-2组合衍生的含184个重组自交系的群体NJRIKY(简称KY)和皖82-178x通山薄皮黄豆甲组合衍生的含142个重组自交系的群体NJRIWT(简称WT)为材料,2004--2006在田间自然虫源下鉴定了筛豆龟蝽抗性.不同年份内以黑霉程度为指标的方差分析结果表明家系间差异在每年都达极显著水平,遗传变异系数都相当大,遗传率中等偏高.利用Windows QTL Cartographer Version 2.5的复合区间作图法(CIM),KY群体的抗性QTL主要位于D1a和C2连锁群,WT群体的抗性QTL主要位于H和D1b连锁群.KY群体3年均检测出的qRMC-d1a-1位于D1a连锁群,贡献率为7.6%～31.4%;2005和2006两年均检测出的qRMC-c2-1位于C2连锁群,与环境有互作,效应相对较小;抗性等位基因来自南农1138-2;qRMC-dla-1和qRMC-h-1在2005年和2006年存在显著的互作.WT群体连锁群H上的qRMC-h-1在3年中都被检测到,贡献率为16.3%～36.2%;D1b连锁群上的qRMC-dlb-2在2004年和2005年被检测到,效应相对较小;抗性等位基因来自通山薄皮黄豆甲.虽然WT群体Dlb和H连锁群上的这2个QTL在KY群体中也有一年被检测到,但2个群体抗性位点基本上是不同的.QTL在不同环境被重复检出,说明大豆对筛豆龟蝽的抗性由稳定的主效QTL所控制,其2侧邻近标记有希望用于标记辅助选择育种.     

基于分水岭和统计矩的大豆籽粒形态参数测量方法

为促进大豆考种及育种工作的高效进行,本研究设计一种大豆籽粒计数和面积、周长、粒长、粒宽等形态参数的测量软件。使用高拍仪采集大豆籽粒和标定板彩色图像,基于"Otsu"阈值法去除图像背景,获得大豆籽粒二值图像,基于分水岭变换法分割二值图中的粘连大豆籽粒,获取了一系列单粒、多粒大豆连通域,对极少数多粒连通域进行籽粒计数校正,实现了大豆籽粒的计数;使用单粒连通域的白色像素点总和来计算大豆籽粒面积,基于freeman链码算法的校正公式计算大豆籽粒周长,使用二阶统计矩求取大豆籽粒的主轴方向并将大豆扭到水平方向,继而计算大豆边界点横、纵坐标的极差来获取粒长与粒宽。用3份不同尺寸的大豆材料来验证本软件的精确性,试验结果表明,大豆籽粒计数准确率可达100%,软件测量与人工测量大豆籽粒的平均粒长和平均粒宽的误差普遍为0.01～0.04 cm,相对误差为3.8%～9.7%,平均相对误差为5.6%。该软件及相应的图像采集装置可以有效地满足农业科学研究工作的准确性要求,同时具有成本低廉,工作效率高的特点。