平菇、杏鲍菇和白灵菇菌丝多糖对·OH、DPPH·和NO_2~-的体外清除作用

为明确平菇、白灵菇和杏鲍菇菌丝多糖对·OH、DPPH·和NO2-自由基的清除能力。利用热水浸提法提取菌丝多糖,Sevag法纯化多糖,利用多功能酶标仪测定对·OH、DPPH·(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)、NO2-的清除率,利用DPS软件和MicroOrigin软件进行数据分析。结果表明,在200～2000μg/mL浓度范围内,白灵菇B10、杏鲍菇PL7和平菇P89菌丝多糖对DPPH·的清除率为5.98%～51.96%,EC50值分别为1.98、2.74和3.28mg/mL;对·OH清除率为43.51%～98.09%,PL7的EC50值溢出最小值,B10和P89的EC50值分别为49.6μg/mL和467.3μg/mL;对NO2-的清除率为10.22%～26.75%,P89的EC50值为5.3mg/mL,PL7和B10的菌丝多糖浓度高于500μg/mL时,清除率不再增加,最高值分别为18.53%和17.52%。菌种间抗氧化能力差异明显,同一菌株对不同自由基的清除能力也存在显著差异。3种供试菌种多糖具有较强的清除·OH能力,中等的清除DPPH·能力和较差的清除NO2-能力。杏鲍菇PL7和白灵菇B10菌丝多糖的清除·OH和DPPH·能力较强,而平菇P89具有较强的清除NO2-能力。     

玉米感染不同致病性玉米大斑病菌后SOD活性的动态变化

[目的]探讨SOD活性与玉米对玉米大斑病的抗性的关系。[方法]采用菌盘接种法将不同致病性的玉米大斑病菌YC和01-23T接种玉米叶片,并测定被侵染后玉米的SOD活性的动态变化。[结果]接种玉米大斑病菌强毒菌株YC和弱毒菌株01-23T后,在1～5 d内玉米叶片SOD活性表现出明显的阶段性:1～3 d逐渐降低,3～4 d逐渐回升,4～5 d又下降;但在1～4 d内,接种处理的玉米叶片SOD活性均高于未接种处理,第5天才显著降低。病菌致病性不同,引起的玉米叶片SOD活性变化不同,其中弱毒菌株01-23T侵染第1天SOD活性极显著高于强毒菌株YC侵染,但2～3 d时与强毒菌株YC无显著差异。[结论]SOD活性对于玉米的抗病菌初始侵染能力具有非常重要的作用,但在发病后抗病菌扩展方面的作用不显著。     

玉米大斑病菌STK2的基因组定位、蛋白质结构预测及其表达

【目的】确定玉米大斑病菌STK2在基因组中的位置;解析目的蛋白质Stk2的结构特征;构建STK2真核表达载体,获得真核表达体系中的胞外分泌蛋白。【方法】利用生物信息学方法,确定STK2在玉米大斑病菌基因组中的确切位置,解析Stk2蛋白质的结构特征;根据STK2的ORF序列及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物,构建真核表达载体,采用电击转化法将重组质粒转入宿主菌 GS115 中进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测并鉴定目的蛋白质。【结果】玉米大斑病菌STK2的ID为91433,该基因位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;成功构建了STK2的真核表达载体pPIC9K-STK2,筛选获得了抗性转化子;在毕赤酵母菌中,经甲醇诱导得到了1个分子量约为41 kD的蛋白质组分且被分泌至胞外,该蛋白质的大小与理论分子量相符,推测Stk2蛋白已在宿主菌中表达并被分泌至胞外。【结论】玉米大斑病菌STK2位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,属于典型的MAPK蛋白激酶;该基因能在真核细胞中表达,获得了可溶性分泌蛋白质,为Stk2蛋白的多克隆抗体制备及基因的功能研究奠定基础。     

外源水杨酸对玉米大斑病菌生长发育的影响

以玉米大斑病菌野生型菌株01-23为供试菌株,观测不同浓度水杨酸处理对病菌分生孢子萌发、菌落生长速度及形态、菌丝发育等方面的影响。结果表明,30μg/mL水杨酸处理对病菌分生孢子萌发有显著的促进作用,处理后24h孢子萌发率是对照的1.53倍。不同浓度水杨酸处理对病菌菌落生长速度也有明显促进作用:15μg/mL水杨酸处理,第8天菌落的生长速度提高了86%;30μg/mL水杨酸处理,第8天菌落的生长速度提高了61%;60μg/mL水杨酸处理,第10天菌落生长速度提高了59%。不同浓度水杨酸处理对菌丝发育也有显著影响:水杨酸浓度为15μg/mL时,菌丝发育没有明显变化;水杨酸浓度为30μg/mL和60μg/mL时,菌丝直径及菌丝形态也无明显变化,但部分菌丝中致密的内含物减少,出现了较分散的空泡状结构,且畸形菌丝的数目增多。水杨酸处理对分生孢子的形态、产生时间及菌落颜色均无明显的影响。     

黄瓜花药愈伤组织细胞的染色体制片技术

在成功获得黄瓜花药愈伤组织的基础上,探索了利用愈伤组织分化产生的根尖细胞进行染色体制片的技术方法,为通过花药途径进行黄瓜单倍体育种的早期染色体倍性鉴定奠定了基础。     

红掌组培变异株的特异DNA片段分析

利用ISSR引物对红掌亲本及其组织培养后代的形态变异株进行2次PCR扩增分析,回收特异DNA片段,测定其扩增产物的基因序列,并用BLAST方法进行同源性分析。结果表明:变异株的基因组特异DNA片段为680 bp,在核酸和蛋白质水平均没有发现同源性较高的基因或蛋白质,说明红掌在组织培养过程中可能产生新的遗传重组,出现新的基因型。     

培养基及花蕾大小对黄瓜花药愈伤组织诱导的影响

以秋唐一号黄瓜为试验材料,比较了MS（MS＋2,4-D 1.0 mg/L＋BA1.0 mg/L＋IAA0.5 mg/L＋蔗糖50 g/L＋琼脂7 g/L）和B5（B5＋2,4-D 1.0 mg/L＋BA1.0 mg/L＋IAA0.5 mg/L＋蔗糖50 g/L＋琼脂7 g/L）两种培养基,以及不同大小花蕾对花药愈伤组织诱导的影响。结果表明,在MS培养基上,愈伤组织生长较快,成活率较高（76.2%）;在B5培养基上,愈伤组织生长较慢,成活率较低（49.6%）。经细胞学显微观察,当花蕾长度为0.9~1.5 cm,花药处于单核中后期时容易诱导产生愈伤组织。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

高渗胁迫对玉米大斑病菌生长发育及STK1表达的影响

【目的】观测高渗胁迫对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）生长发育的影响,探讨甘油是否为病菌细胞中的渗透调节物质,分析STK1在高渗胁迫下的表达规律。【方法】采用2种高渗胁迫条件处理玉米大斑病菌,分析高渗胁迫对病菌生长发育的影响;检测高渗胁迫下菌丝细胞中甘油含量的变化,明确甘油是否为病菌中的渗透调节物质;利用半定量RT-PCR方法,分析高渗胁迫条件下STK1表达规律。【结果】玉米大斑病菌菌丝细胞的等渗液浓度为0.78 mol•L-1;在高渗胁迫条件下,菌落颜色均发生显著变化。1 mol•L-1 NaCl处理后菌落呈红褐色,菌落的生长速率也受到到明显的抑制;在1 mol•L-1NaCl胁迫下菌丝细胞中原生质体浓缩,出现明显的浓缩颗粒;随胁迫时间的延长和渗透胁迫物质浓度的增加,细胞中甘油含量显著增加;STK1在高渗胁迫48 h内表达量稳定增加。【结论】高渗胁迫抑制玉米大斑病菌菌落生长,改变菌落颜色,使菌丝细胞中原生质体高度浓缩,部分菌丝膨大呈球状;甘油是病菌细胞中的一种渗透调节物质;STK1参与调控病菌的渗透胁迫反应。     

玉米大斑病菌ISSR反应体系的优化和遗传多样性分析

以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,采用单因素水平优化的方法对DNA聚合酶的来源及浓度、引物浓度、dNTPs浓度、DNA模板浓度、Tm(退火温度)、PCR反应循环数等重要参数进行摸索和优化,建立了玉米大斑病菌ISSR-PCR优化反应体系,并从40条ISSR引物中筛选出9条多态性较好的ISSR引物。对来自河北、河南、辽宁等玉米主产区的44个菌株进行ISSR分析表明,ISSR标记在我国玉米大斑病菌中存在较高的多态性,多态性条带占40.3%。聚类分析显示,在阈值为0.8时菌株被分为7个类群。对ISSR揭示的玉米大斑病菌的遗传多样性与菌株交配型、地理来源之间的关系进行分析,结果显示菌株的遗传多样性与交配型间的关系密切,而与其地理来源无明显相关性。