有丝分裂雌核发育牙鲆的微卫星鉴定

通过静水压抑制卵裂方法获得多个牙鲆(Paralichthys olivaceus)有丝分裂雌核发育家系,在仔鱼阶段经历大批死亡后,将各个家系残存的个体混合饲养,24个月后获得1批存活个体。利用11对微卫星分子标记,对173尾有丝分裂雌核发育牙鲆进行分析,结果表明,其中111尾在11位点全部纯合,62尾在部分位点杂合,平均杂合子比例为0.2338。11个位点的等位基因数为4～8,平均等位基因数为5.0336,有效等位基因数为2.0421～5.1268,平均有效等位基因数为3.2815。采用NJ法对111尾纯合牙鲆的亲缘关系进行聚类分析,可分为4群。微卫星标记鉴定结果表明,通过静水压抑制卵裂法可以获得完全纯合的牙鲆,但有部分杂合个体出现。分析其原因,可能是由于某些卵子发育不同步,静水压抑制其第二极体排出而非全部抑制卵裂,导致减数分裂雌核发育所致。     

牙鲆efhd2和tbc1d25基因的克隆和表达分析

为在分子水平解析牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊肿病的机理,本研究克隆牙鲆淋巴囊肿抗病免疫相关基因efhd2和tbc1d25的c DNA全序列,运用生物信息学方法对基因序列进行了详细分析;同时,采用荧光定量PCR分析了efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎发育不同阶段、淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织的表达特征。结果显示,efhd2基因c DNA全长为5231 bp,开放阅读框(ORF)长为699 bp,编码232个氨基酸。tbc1d25基因c DNA全长为3173 bp,ORF长为2601 bp,编码866个氨基酸。定量结果显示,efhd2和tbc1d25基因在胚胎发育的各个时期均有不同程度的表达,其中,efhd2在出膜仔鱼期表达量最高,而tbc1d25在受精卵中的表达量显著高于其他时期(P0.05)。在所研究的淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织中,efhd2和tbc1d25基因均有不同程度的表达,抗病个体的血液中,这2个基因的表达量均显著高于患病个体(P0.05)。本研究结果为深入探讨efhd2和tbc1d25基因功能和解析牙鲆淋巴囊肿抗病机理提供了基础资料。     

牙鲆抗淋巴囊肿病家系选育及生长和抗病性能分析

为了选育抗淋巴囊肿的牙鲆(Paralichthys olivaceus)新品种,2015年建立了5个普通家系(C1~C5)、3个雌核发育家系(G1、G2、G3)和1个对照组,在淋巴囊肿病高发养殖场进行自然染毒实验,统计各家系的抗病保护率。同时对各家系120 d、180 d、240 d和300 d时的生长性状进行跟踪测量和比较。结果表明,各家系牙鲆在不同时期有各自不同的生长规律,呈现出家系间生长规律的不一致性。但在所有家系中,家系G2各个时期的生长表现始终排名靠前。390 d统计抗病保护率的结果显示,对照组的抗病保护率只有59.57%,而经选育所有实验组的抗病保护率都在60%以上,最高达97.20%(家系G2)。但总体上,390 d时牙鲆淋巴囊肿抗病和患病个体间体重和体长差异均不显著;体重、体长与抗病保护率为正相关,但相关性均不显著。家系G2抗病个体的平均体重显著高于患病个体(P0.05)。以G2家系为基础,继续进行选育,有望获得牙鲆抗淋巴囊肿速生新品种。     

秦皇岛海域野生牙鲆群体遗传多样性分析

用18对多态性微卫星标记对采自秦皇岛海域的90尾野生牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行遗传分析。18个微卫星位点共检测出161个等位基因;各位点等位基因数为7~11个,平均为8.9;有效等位基因为3.7~8.0,平均有效等位基因为5.9;各个位点多态信息含量为0.69~0.86,平均值为0.80;Shannon多样性指数平均值为1.9;观测杂合度(Ho)值为0.33~0.87,平均值为0.64;期望杂合度为0.74~0.89,平均期望杂合度(He)为0.84。χ2检验表明,18个位点中有9个的等位基因分布偏离了哈迪温伯格平衡(P<0.05)。研究结果表明,秦皇岛海域野生牙鲆群体遗传信息含量丰富、等位基因分布均匀,遗传多样性较高,但是,存在Hardy-Weinberg不平衡现象。     

基于M-C作图鉴定牙鲆不同二倍体的遗传特征

为了分析连锁群上不同位置的微卫星标记对鉴定牙鲆二倍体遗传特征的作用,实验以牙鲆选育基础群体为亲本,选择性腺发育良好的个体制备普通二倍体(ND),减数分裂雌核发育二倍体(MGD-1)、连续两代减数分裂雌核发育二倍体(MGD-2),并利用MGD-1发育达性成熟的雌鱼与同时诱导的性反转伪雄鱼交配制备近交二倍体(MGD1H)。从牙鲆遗传连锁图谱选择均匀分布于24个连锁群的72个微卫星标记,用4个MGD-1家系估计微卫星标记与着丝粒之间的相对距离。在假设无交叉干涉的情况下,17个标记位于着丝粒区域,19个标记位于连锁群中部,36个标记位于远着丝粒区域。分别选择上述区域的微卫星标记鉴定牙鲆4种二倍体的遗传特征。结果显示,4种二倍体的等位基因数(A)和多态信息含量(PIC)在不同区域变化范围较小,ND的A和PIC均为最高,MGD1H则表现为最低。随着标记与着丝粒之间距离的增加,4种二倍体的观测杂合度逐渐升高,纯合度逐渐降低。纯合个体比例在着丝粒区域最高,为8.8%～29.1%;在远着丝粒区域最低,为2.4%～23.2%。其中,MGD-1和MGD-2的变化幅度显著高于其余二倍体。结果表明,选择连锁群上不同位置的微卫星标记对鉴定牙鲆不同二倍体的遗传特征具有显著影响。     

温度对杂合克隆牙鲆性别分化、性比和生长的影响

以有丝分裂雌核发育牙鲆(Paralichthys olivaceus)中的雄性和雌性作为父母本,进行人工授精获得杂合克隆牙鲆。从35日龄起,实验鱼类分别在16、19、22、25、28和31℃水温下培育至110日龄,观察其性别分化、性比和生长的差异。结果表明,性别分化与培育水温密切相关,在22、25和28℃水温下,60日龄开始性别分化;在16℃和19℃下,分别在70日龄和90日龄开始性别分化;而31℃下,110日龄仍未发生性别分化。通过180尾标本的组织切片观察,各温度下的杂合克隆牙鲆均为雌鱼,未发现雄鱼,表明高水温没有改变雌性性别。对于全长和体质量的生长,除31℃外,其他各实验组随着水温升高而生长加快;但是,55日龄后,25℃下的生长超过28℃,成为生长最快的温度。本实验结果证明杂合克隆牙鲆性别分化随水温升高而加快;性别比例不受温度影响,全部为雌性;25℃下牙鲆生长最快。     

牙鲆微卫星分子标记与生长性状的相关性分析

研究利用30对牙鲆微卫星标记,对牙鲆雌核发育家系91个个体基因组DNA进行检测,在30对微卫星标记中,共检测到124个等位基因。其中,各座位的等位基因数3～8个,等位基因片段大小为80～170bp,平均有效等位基因数3.257。其中poli11座位的等位基因数目最多为8。平均多态信息含量为0.6197,平均杂合度为0.6672。利用SAS8.2中的一般线性模型(GLM)对30个微卫星标记与牙鲆的生长性状进行连锁显著性检验。发现在30个微卫星座位中,有8个座位分别与体重、体长、体高显著相关。其中,poli6TUF位点与体重相关;poli30TUF、poli107TUF、poli108TUF、poli116TUF、poli123TUF、poli130TUF6个座位与体长显著相关;poli145TUF与体重、体长显著相关,而与体高相关性不显著。poli9-8TUF与体重、体长、体高3个性状均显著相关(P<0.05)。将基因型与生长性状进行Duncan多重比较,找到4种与生长性状相关的基因型。     

牙鲆连续四代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

为了研究纯合度和遗传相似度在牙鲆(Paralichthys olivaceus)连续四代减数分裂雌核发育家系中的变化规律,本研究利用分布在不同连锁群上的24个高重组率微卫星标记对牙鲆连续减数分裂雌核发育二代(G2)、三代(G3)、四代(G4)家系及普通家系对照组进行了遗传分析。结果显示,24个微卫星位点在对照组、G2、G3、G4家系中,分别检测到96、42、32和32个等位基因,平均等位基因数分别为4.00、1.98、1.33和1.33;期望杂合度分别为0.6416、0.3472、0.1694和0.1492;纯合度分别为0.3503、0.6528、0.8306和0.8508;遗传相似系数分别为0.5822、0.9238、0.9890和0.9988。24个位点中已有17个纯合,但尚有7个保持杂合状态。同时,将上述结果和已发表的减数分裂雌核发育一代(G1)家系的数据进行分析,结果表明,诱导连续减数分裂雌核发育不仅能提高个体的纯合度,同时也可提高子代个体间的遗传相似度;纯合度和遗传相似度在G1、G2和G3家系中能够得到逐步提高,代际之间差异显著(P<0.05);但在G4家系中趋于稳定,与G3家系差异不显著。G4家系的遗传相似性(0.9988)已高于连续20代全同胞交配所获得的理论值(0.9860),连续诱导减数分裂雌核发育是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

Hg2+对克隆牙鲆和普通牙鲆的急性毒性

以相同规格的牙鲆Paralichthys olivaceus普通群体为对照,采用静水生物测试法开展了Hg2+对牙鲆克隆群体的急性毒性实验,实验所用幼鱼为130日龄,体长为(12.38±1.13)cm,体质量为(17.97±5.79)g。实验期间,水温为(21±1.2)℃,pH为8.1-8.3,盐度为31.0,硬度6200 mg/L,连续充气保证溶氧充足。研究表明,实验初始阶段,高浓度组克隆牙鲆在容器内躁动不安,上升到水面沿池壁缓慢转圈游动,一段时间后安静伏在池底;而普通牙鲆则仅个别鱼在水面游动,多数静止在池底不动。随中毒程度加深,用玻璃棒触碰普通牙鲆时,其反应剧烈,在水中侧翻、打转、急速游动或上下窜动,而克隆牙鲆则仅沿池底缓慢游动。最终克隆牙鲆和普通牙鲆均身体僵直,失去呼吸能力死亡。Hg2+对克隆牙鲆的24、48、96 h的半致死质量浓度分别为1.50、0.86、0.84 mg/L,而对普通牙鲆的半致死质量浓度则分别为1.93、1.04、0.90 mg/L。结果表明,克隆牙鲆对Hg2+的耐受性弱于普通牙鲆,对Hg2+更加敏感。从死亡过程看,各处理组的克隆牙鲆从出现死亡个体开始,死亡时间集中在8 h内,具有同步性;普通牙鲆则在实验期间陆续出现死亡,持续时间较长,同步性较差。