大连刺参体腔液甘露糖结合凝集素序列的鉴定及分析

根据NCBI提交的刺参体腔液(Apostichopus japonicus)甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectins,MBLs)序列(AY625513)设计引物,抽取刺参体腔液进行总RNA提取,采用RT-PCR技术,获得498 bp目的片段。通过克隆、测序确定得到刺参MBLs序列。将得到序列进行核苷酸和氨基酸序列比对,鉴定了大连刺参MBLs序列,并为我国不同区域刺参的进一步分类提供了科学的分子水平依据。     

贻贝凝集素生物活性的研究

从海洋无脊椎动物贻贝中分离出的凝集素(CGL),为N-乙酰半乳糖胺/半乳糖(GalNAc/Gal)特异性的凝集素。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其相对分子量为18 000。其血凝活性不依赖钙离子的存在。在植物凝集素(PHA)存在的条件下,CGL具有体外促进小鼠脾细胞增殖的活性。同时,它还具有抑制酶活性,其抑制50?E的浓度(IC50)为6.82 mg/m l和促进体外离体兔回肠蠕动的作用。     

虾夷马粪海胆体腔液中调理素样分子的研究

为研究虾夷马粪海胆体液免疫机理,测定其体腔液吞噬细胞在不同介质中对不同处理的酵母细胞的吞噬作用。对其无细胞体腔液、从调理及非调理酵母细胞分离出的成分进行SDS-PAGE分析,同时对无细胞体腔液进行透析、SephadexG-200凝胶层析和SDS-PAGE分析,在等渗缓冲液和酵母细胞吸附的无细胞体腔液中,测定不同调理素样分子浓度和不同反应时间时吞噬率的变化。结果显示,吞噬细胞在3种介质:等渗缓冲液、酵母细胞吸附的无细胞体腔液和无细胞体腔液中对非调理酵母细胞吞噬率之比为1.00∶1.11∶1.94,在等渗溶液中对调理酵母细胞的吞噬率是非调理酵母细胞的1.61倍;从调理酵母细胞分离出的成分在SDSPAGE中显示一条调理素样分子带,分子量为250.62 ku。经透析和SephadexG-200凝胶层析后,测得纯化的调理素样分子的分子量为250.62 ku;在所测试的浓度范围内,调理素样分子浓度越大,吞噬活性越高,且5.0和10.0μg/mL组在各个测试时间均比对照组高。在等渗缓冲液中,反应30 min时,10.0和5.0μg/mL组与对照组均有极显著差异(P0.01),在酵母细胞吸附的无细胞体腔液中,反应30 min时,10.0μg/mL组与对照组有显著差异(P0.05)。结果表明,在虾夷马粪海胆体腔液中发现一种调理素样分子,分子量约为250.62 ku,一定浓度的调理素样分子能显著提高虾夷马粪海胆体腔液吞噬细胞的吞噬活性。     

海萝凝集素的分离纯化及性质

海萝(Gloiopeltis furcata)经PBS缓冲液抽提、硫酸铵分级、DEAE-52纤维素离子交换层析和SephadexG-200分子筛层析，从中纯化出海萝凝集素(GFL)，在PAGE和等电聚焦电泳上各显示单一蛋白染色带，其等电点为9．0。用SephadexG-200分子筛层析测得其相对分子质量为8318。海萝凝集素除对人血型红细胞无凝集活性外，对单胞藻及兔、鲤、鲫的红细胞均表现出一定程度的凝集活性，对兔红细胞的凝集活性最强，且不被已测试的D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖所抑制，而被D-甘露糖、牛甲状腺球蛋白、鸡卵白蛋白、γ-球蛋抑制。该凝集素在pH4．0～10．2均有活性，而在pH6．5～9．1时活性较高。该凝集素在90℃加热1h，活力并未减弱，说明这种凝集素具有很强的耐热性。     

角叉菜凝集素的分离纯化及其性质

角叉菜（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｏｃｅｌｌａｔｕｓ）经磷酸盐缓冲液抽提,２０％～７５％硫酸铵分级沉淀,牛甲状腺球蛋白－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,可以从红藻角叉菜中纯化出角叉菜凝集素（ＣＯＬ）,在ＰＡＧＥ上显示单一蛋白染色带,在等电聚焦电泳上显示单一蛋白染色带,其ＰＩ为８．３０,纯化后的ＣＯＬ的最大此外吸收峰在２８５ｎｍ,用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析测得其分子量为４２５２。该凝集素可以凝集     

刺参甘露糖结合凝集素的原核表达、纯化及生物活性分析

为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni²⁺离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集最小浓度为10 μg/mL。本实验成功构建了AJ-MBL原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了17 ku AJ-MBL蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性。