小麦FtsH2蛋白与WYMV CP互作研究

 小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)是马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,主要危害冬小麦。实验室前期以WYMV外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵,通过酵母双杂交筛选小麦cDNA文库,发现FtsH2蛋白部分片段与WYMV CP互作。FtsH2蛋白是AAA蛋白酶家族成员,参与植物叶绿体光损伤修复和类囊体发育进程。本研究利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步对FtsH2蛋白全长与WYMV CP进行互作验证,并鉴定互作结构域;利用荧光蛋白标记技术研究FtsH2蛋白与CP的亚细胞定位。实验结果表明FtsH2蛋白全长与CP互作;两者互作的关键结构域包含FtsH2蛋白低复杂区、跨膜区及AAA结构域和WYMV CP的中段区域(61-293 aa)。FtsH2蛋白单独表达时定位在细胞质、细胞核和叶绿体;CP单独表达时定位在细胞质;两者共同表达时亚细胞定位均没有发生明显变化,且主要共定位于细胞质中。WYMV CP与小麦FtsH2蛋白的互作可能会干扰植物绿叶体的发育和功能。本研究对了解WYMV的症状形成机制具有一定意义。     

假禾谷镰刀菌LAMP快速检测方法的建立

<正>假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)1999年由Aoki等[1]在澳大利亚首次发现,是引起冠腐病和赤霉病的主要病原,该病菌在世界小麦产区造成严重的经济损失,包括澳大利亚、北美、土耳其、和新西兰等地区,在澳大利亚冠腐病对小麦生产造成的损失超过了5 600万美元。特别在昆士兰、威尔士南部和澳大利亚南部的部分地区发生尤为严重。2011年Li等[2]在中国河南省矮抗58小     

假禾谷镰孢细胞凋亡基因FpTatD的鉴定与表达分析

【目的】鉴定和克隆假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)细胞凋亡相关基因FpTatD,分析FpTatD在假禾谷镰孢菌丝、分生孢子和侵染不同时期的表达,为探索细胞凋亡在假禾谷镰孢侵染过程中的功能提供理论依据。【方法】从GenBank获得模式物种已知的TatD氨基酸序列,利用BLASTP的方法在镰孢中鉴定TatD同源蛋白,并构建进化树;分别以假禾谷镰孢的基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR方法克隆假禾谷镰孢FpTatD的基因序列和开放阅读框（ORF）序列;利用实时荧光定量PCR方法分析FpTatD在假禾谷镰孢生长、产孢及侵染不同时期的表达;利用转录组测序方法分析FpTatD在假禾谷镰孢与感病小麦和抗病小麦互作中的表达差异。【结果】镰刀菌中有4个保守的TatD同源蛋白,与其他物种的TatD蛋白构建系统进化树,发现TatD在进化上分成两个大的分支,第一个分支的TatD在所有物种中都非常保守,包括镰刀菌的TatD1和TatD2,第二个分支的TatD蛋白属于植物和真菌特有的,包括镰刀菌的TatD3和TatD4;克隆假禾谷镰孢的FpTatD1、FpTatD2、FpTatD3、FpTatD4基因长度分别为993、1 331、1 227、1 176 bp,ORF区长度为993、1 182、1 227、1 176 bp。FpTatD2 5′端包含两段长度为94和55 bp的非编码序列,FpTatD1、FpTatD3和FpTatD4均不含非编码序列。4个FpTatD编码蛋白质的分子量大小分别为36.37、43.13、45.59、44.25 kD。蛋白结构和序列分析显示FpTatD蛋白均具有明显的DNase结构域以及大部分保守的氨基酸位点;实时荧光定量PCR分析显示,FpTatD1和FpTatD2在假禾谷镰孢中的表达量高,且在侵染初期阶段明显诱导表达,尤其是FpTatD1在侵染36 h和3 d时分别上调表达8.8倍和7.6倍;而FpTatD3和FpTatD4表达量非常低,且在不同阶段的表达量无明显变化,说明FpTatD1和FpTatD2在假禾谷镰孢中起主要作用;通过分析假禾谷镰孢与感病小麦国麦301和抗病小麦周麦24互作的转录组数据,与实时荧光定量PCR结果一致,FpTatD1和FpTatD2表达量高,并在侵染阶段上调表达,而且相对于假禾谷镰孢与感病小麦的亲和互作中,其与抗病小麦的非亲和互作中,FpTatD诱导表达倍数更高。【结论】假禾谷镰孢细胞凋亡相关基因FpTatD可能参与病原菌与寄主的互作过程。     

SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×10³ copies/μL, real-time PCR的灵敏度可达到6.5×10² copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。     

环保型营养液对水培露草的影响

为进一步观察环保型营养液对于水培花卉的影响，我们于2004年4～6月在本院园艺场进行了试验，现报道如下。     

瓜类褪绿黄化病毒p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材 料,采用RT-PCR 方法克隆其P22 蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3 上,PCR 验证及克隆 测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22 转化大肠杆菌BL21 菌株,诱导表达,SDS-PAGE 分 析表明,经IPTG 诱导,p22 基因在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家 兔,制备了CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明,血清效价高达1.28 × 10⁵。Western blot 检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV 侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22 蛋白。     

抗病毒RNA沉默和病毒拮抗RNA沉默策略研究进展

RNA沉默通指在转录或转录后水平上由RNA介导、序列特异性地降解靶标RNA从而抑制基因表达的过程。在动物、真菌和植物中,RNA沉默是通过小RNA的形成来抵御病毒侵染的,病毒自身可以作为RNA沉默的诱导子和靶标。病毒通过进化形成积极的和消极的策略来对抗RNA沉默。为此,主要讨论了siRNAs和miRNAs介导的抗病毒RNA沉默以及病毒蛋白和RNA介导的沉默抑制作用,有助于阐明病毒侵染与寄主之间的相互关系,为抗病毒研究奠定基础。     

利用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P1互作的寄主蛋白

正小麦黄花叶病是我国冬小麦上重要的病毒病害之一,自20世纪90年代以来,每年发生面积都在66万hm~2以上,一般减产10%~30%,严重的达70%以上。该病害在我国河南、江苏、山东、安徽、陕西、湖北、四川等省均有分布,并且呈逐年蔓延趋     

拮抗乳酸菌的筛选及其对黄瓜炭疽病的防治效果

为了探讨乳酸菌对植物病害的生防作用,从食品中筛选植物病原拮抗乳酸菌,并研究其对13种植物病原菌的抑菌效果及对黄瓜炭疽病的室内和田间防治效果。采用不同的乳酸菌培养基,从豆腐乳和泡菜中分离、筛选出8株不同的乳酸菌。抑菌测定结果表明,各菌株对黄瓜炭疽病菌均有一定的拮抗作用,其中以L2拮抗作用最强,L3和L8次之。从中筛选出拮抗乳酸菌L2作为黄瓜炭疽病的生防菌,室内测定结果表明,该菌对黄瓜炭疽病菌的抑菌率为43.67%,稀释10倍的发酵滤液对病菌菌丝生长的抑制作用优于对照10 000个单位的农抗120液,盆栽和温室小区接种L2的防病效果分别为62.98%和54.19%,与农抗120液的效果相当。研究还发现,L2对供试的其余12种病原菌均有抑菌效果,其中对烟草赤星病菌、玉米大斑病菌和黄瓜灰霉病菌的抑菌效果最好。因此,乳酸菌对于植物病原菌具有一定的防治效果。