建鲤基因组中一个ty3-gypsy反转录转座子的发现与分析

转座子是动植物基因组的重要组成部分,在前期研究中发现建鲤(Cyprinus carpio var.jian)基因组中存在一个ty3-gypsy反转录转座子类型的转座子,并将其命名为JRE转座子(Jian carp Retrotransposon,JRE)。为了研究JRE反转录转座子在建鲤基因组中的功能,采用PCR扩增、荧光定量PCR和原位杂交等方法对JRE转座子的特性进行了研究。JRE反转录转座子全长5126 bp,具有5?端470 bp和3?端453 bp长末端重复片段(long terminal repeat end,LTR),中间的开放阅读框(ORF)包括核心蛋白基因(gag)和酶基因区域(pol),其长度为4203 bp。pol基因具有典型的ty3-gypsy反转录转座子结构,基因顺序为PR-RT-RH-IN基因。对pol基因的同源分析表明,其与虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Azumapecten farreri)、大堡礁海绵(Xiphophorus maculates)和斑剑尾鱼(Xiphophorus maculates)pol基因相似性分别为40.7%、40.0%、32.8%和30.1%,因此JRE可能属于JULE反转录转座子家族。采用实时定量PCR对JRE转座子在建鲤基因组内的拷贝数进行了测定,结果表明其拷贝数为124,同时对不同组织中的m RNA表达量的研究表明,JRE转座子在建鲤肝、肾、血、肌肉、性腺5种组织中均有表达,在肾和肝中表达量略高。染色体原位杂交结果表明,JRE转座子在建鲤的染色体上随机分布,没有明显的规律性。本研究表明,JRE转座子具有典型的反转录转座子结构,属于JULE转座子的分枝,在染色体上的分布不多,其转录活性并不是很高,对我们了解建鲤基因组构成和特点增加了知识储备,同时为利用转座子的活性进行转基因研究提供了一种新的途径和工具。     

实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量

建立转基因成分灵敏、准确的定量标识是实施转基因安全阈值管理的一个基本步骤,其中实时定量PCR技术是检测产品中转基因含量的主要技术方法。本研究利用该技术确定了双价(cry1Ac+CpTi)转基因抗虫水稻(Oryzasativa)科丰6号中有3个拷贝的外源基因插入。通过对外源基因Bt和转化事件特异的边界特异序列为对象的绝对定量和相对定量检测方法的研究,发现以边界特异序列为对象的事件特异性检测和以目的基因Bt为对象的检测都能够满足相对定量检测的要求。在100ng基因组DNA中,Bt基因和特异性检测的相对定量检测限分别为0.1%和0.5%,在绝对定量检测中,特异性检测的检测限为5个拷贝。不同检测方法对4个已知转基因含量的样品检测结果与预期均一致。结果表明,以转基因产品占总产品比例为定义的转基因含量的测定中,多拷贝或单拷贝基因为对象的不同定量方法的检测对转基因产品的相对定量结果没有影响,本研究对转基因产品的定量阈值设定具有一定的借鉴意义。     

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数

微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。     

利用猪1.4M高密度SNP芯片检测巴马香猪全基因组拷贝数变异

旨在检测巴马香猪基因组上的拷贝数变异（CNV）,并探究标记密度对于CNV检测效率和准确率的影响。本研究利用319头巴马香猪（其中阉公猪160头和母猪159头）1.4M高密度SNP芯片的数据,采用PennCNV和R-Gada两种软件进行CNVs检测;然后通过重叠CNV融合法,构建拷贝数变异区域（CNVR）,并用全基因组关联分析（GWAS）对频率大于5%的CNVR进行验证;最后根据不同的标记密度,均匀抽取一定数目的SNPs来探究标记密度对CNV检测效率和准确性的影响。结果,PennCNV和R-Gada软件分别检测到6 327和3 489个CNVs,分别构成795和340个CNVRs,其中226个为共同CNVRs。在这226个共同CNVRs中,最短的为3.98 kb,最长的为1 297.78 kb,总长度为33.27 Mb,其中102个（45%）与前人报道的CNVRs重叠。在PennCNV检出的795个CNVRs中,有135个频率大于5%,其中20个得到GWAS验证,验证率为15%。随着SNP密度的逐渐增加,CNV的检测效率和检测准确性不断提高,尤其是小片段CNVs的检测效率。本研究利用1.4M SNP芯片的数据,通过PennCNV和R-Gada软件绘制巴马香猪CNVR的草图,为将来鉴别与重要经济性状相关的CNVRs奠定了基础。同时,揭示了标记密度对CNV检测效率和准确性有正面影响,为后续CNV研究选择合适的标记密度提供了一定的参考。     

Inverse PCR法快速测定转基因马铃薯中T-DNA的拷贝数

利用Inverse PCR技术分析原生质体途径导入PLRV-CP基因的马铃薯转基因后代T-DNA拷贝数,结果与Southern Blot相同。经RT-PCR分析,低拷贝数的转基因后代显阳性反应,多拷贝数的显阴性反应,说明T-DNA多拷贝数影响外源基因的表达。Inverse PCR技术能为早期快速准确预测转基因植株中外源基因的T-DNA拷贝数,排除多拷贝重复串联序列诱导的外源基因沉默植株,为获得稳定表达的转基因株系提供有效方法。     

河南4个家蚕品种ADF 1基因拷贝数变异检测及群体经济性状分析

家蚕是我国重要的经济昆虫之一,长期以来,如何让家蚕吐的丝又多又好,是研究者十分关心的问题。随着我国家蚕功能基因组学等研究的突破,将分子育种同传统育种相结合的育种方法在家蚕生产和研究中得到了广泛应用。已有研究推测,ADF 1基因的拷贝数变异可能会对家蚕的经济性状产生影响。通过对ADF 1基因不同拷贝数变异类型在4个家蚕品种中的分布以及群体生活力和生产性状进行分析,发现4个家蚕品种在全茧量、茧层量、茧层率、普通茧率和同宫茧率等方面均有显著差异（P<0.05）,4个群体中ADF 1基因的拷贝数变异也存在明显差异,这些结论为相关基因的深入研究提供了有效的基础材料,可以为这些品种的种性维系和其他品种的选育提供帮助。     

脊尾白虾不同发育期mtDNA拷贝数变化特征分析

为了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)在不同发育期线粒体基因组(mtDNA)拷贝数的变化特征,本研究共采集其8个时期(受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期)的DNA样品,利用TaqMan实时荧光定量PCR技术,对上述各发育期单个细胞中的mtDNA拷贝数进行了测定。检测结果显示,脊尾白虾受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期的mtDNA拷贝数的均值分别为2366、2648、2644、2873、3559、9948、6452和8872。进一步统计分析结果显示,mtDNA拷贝数与发育时间存在正相关性,相关系数为0.83。研究表明,随着脊尾白虾不断生长,其单个细胞中mtDNA拷贝数总体呈上升趋势。     

三个贵州地方猪品种SERPINA3基因拷贝数变异的多态性研究

为了研究地方猪品种SERPINA3基因拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)的多态性变化,采用实时荧光定量PCR方法,对香猪、糯谷猪和柯乐猪3个贵州地方猪品种的SERPINA3基因的拷贝数进行了分析,并与大白猪相比较。结果显示,在4个猪品种中,SERPINA3基因的拷贝数均以增加为主,香猪的SERPINA3基因的拷贝数最少,为10.45±0.37,大白猪的拷贝数最多,达18.02±0.92,糯谷猪与柯乐猪分别为14.40±0.94、14.05±0.91。其中香猪、糯谷猪和柯乐猪3个贵州地方猪品种的SERPINA3基因拷贝数与大白猪相比差异极显著(P0.01),糯谷猪与柯乐猪之间的差异不显著(P0.05),糯谷猪和柯乐猪与香猪相比差异极显著(P0.01)。结果提示:SERPINA3基因的拷贝数在猪品种之间存在丰富的多态性变化。     

Study on Genome Copy Number Variation of Sheep in Northern China

To detect the association of the biological traits and genetic properties in sheep genome,array comparative genomic hybridization (aCGH) system was used to identify the CNVs in the sheep genome and the CNVs map was constructed in Mongolian sheep,Kazakh sheep and Tibetan sheep.The results showed that 28 CNV regions (CNVRs) were found,containing 11 gains,15 losses and 2 gain-losses.The HBB gene was amplified in Mongolian sheep and Tibetan sheep,which might be attributed to adaptability in low oxygen and high altitude environment.Real-time PCR was performed for CNVRs and CNV genes,83.3% of Real-time RCR results were consistent with the CGH.The study that performed the genome-wide detection of copy number variations of sheep in Northern China,would provid foundation for studying genetic variation in different sheep breeds.     

皱皮香猪3个基因组拷贝数变异的多态性分布

为探究皱皮香猪个体产生皮肤变异的根本原因,本文基于重测序数据,采用生物信息学分析皱皮香猪基因组中的拷贝数变异(CNV),通过荧光定量 PCR 方法检测皱皮香猪中 3 个 CNVs 的拷贝数变异规律,并与香猪和大白猪进行比较。结果表明:3 个 CNVs 在猪群中的拷贝数变异呈现出多态性变化,皱皮香猪中CNV1以拷贝数缺失型为主,其中的 MPC1和 RSK3基因可能与脂肪沉积有关;皱皮香猪 CNV2和 CNV3以拷贝数增加型占优势,其中的 CCL17和 CX3CL1基因参与皮肤等组织的炎症反应,可能通过剂量效应引起香猪皮肤产生褶皱。