PCR-RFLP和特异PCR技术用于鲁道夫对盲囊线虫鉴定的研究

本研究运用新建立的Contracaecum rudolphii姊妹种的PCR-RFLP和特异PCR鉴定方法对来自我国青海湖的鲁道夫对盲囊线虫进行分子鉴定。经PCR-RFLP分析，来自我国青海湖的鲁道夫对盲囊线虫的两个样品的带型与C．rudolphiiB的酶切带型一致。经特异PCR扩增，C．rudolphii B的特异引物能从我国鲁道夫对盲囊线虫中扩增出目的片段，与对照C．rudolphii B的代表样品扩增片段大小相同。该两种方法试验结果都说明来自我国青海湖的对盲囊线虫为C．rudolphii B，与PCR-SSCP方法鉴定结果一致。本次研究结果及所建立的分子分类学方法为我国异尖线虫的进一步研究奠定了基础。     

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

 为了筛选线虫的性别特异性基因，为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具，本研究选择猪蛔虫（Ascaris suum）为模型，分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后，采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交（SSH），构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库，并采用地高辛（DIG）标记的cDNA探针进行Southern 杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明，雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析，发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs，5个新的ESTs；25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs，还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建，为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。     

我国猪毛尾线虫线粒体NADH脱氢酶亚单位1基因遗传变异的研究

毛尾线虫又称鞭虫,为人体和动物肠道常见的人兽共患寄生线虫[1].全世界鞭虫感染人数已超过10亿[2],而猪的鞭虫病更为普遍,一年四季均可发生且感染强度较高,对养猪业的发展威胁很大[1].有鉴于此,对鞭虫的防控刻不容缓,而正确分析不同地区猪毛尾线虫的遗传变异,不仅具有重要学术价值,而且对预防和控制该病也具有重要意义.     

Contracaecum rudolphii姊妹种特异 PCR鉴定方法的建立

参考已测得的C．rudolphii姊妹种（C．rudolphii A和C．rudolphii B）及C．septentrionale的核糖体DNA（rDNA）内转录间隔1、2（ITS-1及ITS-2）核苷酸序列，设计、合成了针对C．rudolphii A、C．rudolphii B及C．septentrionale的特异性引物HFA（F）、HFA（R）、HFB（F）、HFS（F），通过PCR条件优化和扩增后，它们均能特异地扩增出目的DNA片段，分别是323、321、108bp，而其它对照样品均未扩增出特异性片段，敏感性试验可检测到最低浓度分别为1．6、21．8、0．27ng／μL。从而初步建立了鉴定C．rudolphii姊妹种的特异PCR方法。该方法特异性强、敏感度较高、重复性好，不仅可用于C．rudolphii姊妹种的分类鉴定，也可用于它们所导致的寄生虫病的诊断和流行病学调查。     

猪蛔虫雄虫cDNA文库的构建

采用Tripure Isolation Reagent抽提猪蛔虫雄虫成虫的总RNA,用poly(A)PuristTM纯化试剂盒分离mR-NA。分离mRNA后,用Clontech公司的CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了猪蛔虫雄虫成虫的cDNA文库。结果获得了7.26×105独立克隆,重组率达96.7%,插入片段的平均长度约为1 kb。猪蛔虫雄虫cDNA文库的成功构建为利用文库筛选雄虫差异表达基因提供了材料来源,为研究猪蛔虫性别发育的分子机制奠定了基础。     

我国片形吸虫线粒体NADH脱氢酶亚单位1基因(nad1)多态性的研究

用γ^33P对引物进行标记，首次对来自国内不同地区、不同宿主的片形吸虫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位Ⅰ基因部分序列(pnad1)进行PCR扩增及DNA单链构象多态性(PCR-SSCP)分析，结果76个虫体均成功地扩增出约200bp的基因片段；76个样品经过PCR-SSCP分析后，筛选出11个代表性样品进行测序。测序结果显示我国片形吸虫pnad1序列种间差异大于种内变异，表明nad1序列可以作为片形吸虫种内和种间遗传多态性研究的标记。     

鸡蛔虫ITS rDNA的PCR扩增克隆及序列分析

鸡蛔虫(Ascaridia galli)寄生于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡等鸟禽类的小肠,偶见于嗉囊、胃和食道.鸡蛔虫病分布于全世界和全国各地,在我国具有分布广、感染率高、感染强度较高的特点[1].     

鸡异刺线虫ITS rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析

应用PCR方法用保守引物NC5及NC2，扩增了从广州地区鸡体分离的鸡异刺线虫rDNA的第一、第二内转录间隔区（ITS-1，ITS-2）及5．8S基因。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM—TEasy载体。用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落进行测序。试验结果表明，ITS-1长为428bp，ITS-2长为386bp。通过与网上发表的来自澳大利亚的鸡异刺线虫基因序列比较结果表明。广州鸡体内的异刺线虫和澳大利亚鸡异刺线虫的ITS-2序列是完全一样的，ITS-1序列有微小差异，广州鸡的2个不同虫体样本的ITS序列完全一致。本项研究结果为鸡异刺线虫的进一步分子生物学研究奠定了基础，并为寄生虫分子系统学研究提供了资料。     

用PCR-RFLP技术鉴别鲁道夫对盲囊线虫姊妹种的研究

用保守引物扩增鲁道夫对盲囊线虫Contracaecum rudolphii姊妹种和C．septentrionale rDNA第一内转录间隔区(ITS-1)片段并纯化,根据鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B和C．septentrionale rDN ITS-1序列,选用限制性内切酶Msp Ⅰ和Nsi Ⅰ酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析．结果经Msp Ⅰ酶切后,鲁道夫对盲囊线虫姊妹种与C．septentrionale表现出不同的条带;经Nsi Ⅰ酶切后,鲁道夫对盲囊线虫B和C．septentrionale结果一致,与鲁道夫对盲囊线虫A不同．用MspI可以鉴定出C．septentrionale,用Nsi Ⅰ可以鉴定出鲁道夫对盲囊线虫A,2个限制性内切酶合用可以将鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B以及C．septentrionale分别鉴定出来．根据鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B以及C．septentrionale rDNA ITS-1基因序列建立的鲁道夫对盲囊线虫姊妹种PCR-RFIP鉴别技术能够对鲁道夫对盲囊线虫姊妹种进行准确、特异和简便的鉴别．     

有齿食道口线虫msp基因的克隆与表达

以有齿食道口线虫为研究对象,扩增出其雄虫的msp基因,克隆至质粒载体pTrcHis-B中,构建了msp基因重组原核表达载体.经测序表明,目的基因msp已以正确的阅读框架整合至表达质粒中.应用大肠杆菌Top10为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含msp基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE分析,表明表达蛋白大小正确,表达量高.