大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的获得

以大麦黄矮病毒GPV株系的RNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,扩增出1134bp的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到pUC19的SmaI位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒pUC19D。以KpnI和XbaI从pUC19D上切下此基因并插入质粒pEmu-mcs-N得到植物表达载体pPPI8。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴127、陕160和晋麦47,通过卡那霉素抗性筛选、PCR和PCR-Southern检测,3个品种均获得了转基因小麦植株。     

转基因水稻对病原菌侵染的反应和防卫基因的表达分析

 为了阐明OsBTF3基因在水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染抗/感反应中的功能,本研究以OsBTF3过量表达和RNAi转基因株系为材料,比较分析了T1代株系对病菌侵染的抗感病反应,定量测定了防卫基因的表达动态。结果表明,与野生型对照株相比,无论过量表达株系,还是RNAi株系对Xoo和Xoc侵染均表现为更加感病的反应; 经Xoo接种后,过量表达和RNAi株系OE37和RNAi株系RI30防卫基因的表达发生了不同程度的变化。因此,OsBTF3增量/减量表达对水稻抗/感病性具有重要的调控作用,这种作用可能并不依赖于水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)介导的信号途径。     

建立以lipA和purH为靶基因的RTQ-PCR方法对水稻白叶枯病菌侵染过程进行定量分析

 【目的】建立水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）的分子定量法，测定Xoo侵染水稻植株后不同时间的种群量及其变化。【方法】选用以lipA和purH为靶基因序列的引物P4和P5，用SYBR Green I实时定量PCR（RTQ-PCR）分析在水稻接种植株内的病菌种群量。【结果】与细菌平板计数法相比，RTQ-PCR法定量结果基本相近或略高（≤10倍），变化趋势基本相似，用2对引物P4和P5进行RTQ-PCR定量无显著差异。接种3 d的植株内己有菌量积累，但不显症；从接种5 d开始，细菌明显增加，植株显症并逐渐加重；接种9～14 d菌量增加到峰值，并进入稳定平台期，植株显症严重。病菌种群量与植株显症间的关系可能与细菌群体感应机制有关。【结论】用RTQ-PCR分子定量法可以直接对水稻植株内的Xoo进行动态定量研究；提出了水稻病害分子定量“病菌靶基因拷贝数－DNA总量－种群量－植物病症”的研究模式。     

两种黄单胞病菌诱导水稻一氧化氮产生和防卫基因表达的比较研究

 【目的】阐明在不同黄单胞病菌诱导的水稻过敏性细胞死亡(HCD)中的一氧化氮(NO)信号途径及其作用机制。【方法】比较分析了在水稻细胞－番茄斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)不亲和互作、水稻－白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae, Xoo)亲和互作中NO的发生以及NO对水稻防卫基因诱导表达的影响。【结果】Xcv不仅诱导了NO的迸发、NOS活性及其NO合成相关基因(nos和nr)的表达，而且诱导了防卫基因(苯丙氨酸解氨酶基因pal、过氧化物酶基因pox和谷胱苷肽转硫酶基因gst)的表达；Xoo不诱导NO的迸发，抑制了NOS的活性、NO合成相关基因和防卫基因的表达；NO清除剂PTIO和Xoo显著地抑制了Xcv 对防卫基因表达的诱导作用。【结论】Xcv通过NO信号途径诱导了水稻防卫基因的表达和HCD；Xoo 通过NO抑制或解毒机制抑制了由NO介导的防卫基因的表达及其HCD的发生。     

水稻白叶枯病菌双组分调控系统应答调节子基因gacAxoo的功能鉴定

为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)双组分系统(TCS)的调控作用,本研究通过基因克隆、序列分析、缺失突变和互补、表型测定,对TCS应答调节子基因gacAxoo的功能进行了鉴定。克隆的gacAxoo基因编码蛋白GacAxoo与其它病原黄单胞菌的同源序列高度保守。GacAxoo是LuxR蛋白家族成员之一,具有磷酸受体结构域(REC)和DNA结合保守结构域(HTH)。用基因标记交换法,构建了△gacAxoo基因缺失突变体。与PXO99A相比,△gac-Axoo的致病性、致敏性、胞外降解酶类活性和嗜铁素产生能力无显著变化,但运动性明显减弱,基因互补可以使之恢复。因此,gacAxoo基因可能参与了Xoo运动性的调控。     

大豆根组织受尖孢镰刀菌侵染后基因表达反应的cDNA-AFLP分析

 为了阐明大豆受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum,Fo)侵染后在基因转录水平上的感病反应,本研究用cDNA-AFLP方法,对Fo浸根接种后大豆根组织进行了基因转录谱的银染法检测分析。结果表明,在测定的大约1 000个大豆cDNA扩增片段(TDFs)中,16个是差异性表达的,其中9个受Fo诱导上调表达,7个被抑制下调表达。对这些差异性表达的TDFs进行克隆、测序及其同源性进行分析,发现其中6个具有已知或推断的生物学功能,包括钙调素结合蛋白(CaMBP)、BURP结构域蛋白和羟基多花碱-羟基烷宁转移酶等,其余10个功能未知。这些可能参与大豆感病性的差异性表达新基因片段的发现,为开展大豆感病性功能基因组学研究提供了材料。     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

水稻与白叶枯病菌互作的功能基因组学研究

水稻白叶枯病是水稻生产上重要的细菌病害之一。随着水稻和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)全基因组序列的完成,该病害己成为植物-病原物互作研究的模式。水稻-Xoo互作涉及到寄主与病原菌因子的时空表达和严密调控。因此,阐明互作基因的表达调控机理,对于全面解析水稻-Xoo互作机制具有重要的科学意义。本文介绍了近年相关工作的研究进展。1Xoo基因鉴别和功能分析1.1Xoo侵染的基因表达谱和分子量化根据Xoo基因组序列信息,自主研制了载有调控基因、致病基因、特有基因以及保守基因特异片段的基因芯片,成功地用于在离体培养、…     

H2O2对水稻白叶枯病菌过氧化氢酶相关基因crg表达的诱导作用

 为了阐明H₂O₂对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)过氧化氢酶(CAT)相关基因(crg)表达的诱导作用,本研究定量分析了在水稻细胞-Xoo互作体系及其加入H₂O₂清除剂CAT后H₂O₂产量和crg表达;外源添加H₂O₂后的病菌生长和crg表达。结果表明:在互作条件下,H₂O₂含量稳定增加,10 h可达到峰值;在互作6 h时crg显著地被诱导表达;加入CAT显著地降低了H₂O₂含量和crg表达;在外源H₂O₂胁迫条件下,H₂O₂以浓度效应的方式影响病菌增殖,显著地诱导了catB和srpA表达。因此,Xoo-水稻互作导致了H₂O₂的发生。无论是互作产生的还是外源的H₂O₂均显著地诱导了Xoocrg表达,从而活化了H₂O₂降解途径。