圆叶唇柱苣苔的组织快繁和离体保存研究初探

云南特有圆叶唇柱苣苔Henckelia dielsii (Borza) D.J.Middleton & Mich. Mller具有较高观赏价值,适宜岩石造景和庭院盆栽。研究比较8种不同培养基对外植体增殖和生根的影响,结果表明,培养基1/2MS+NAA 02 mg·L-1+6 BA 20 mg·L-1的增殖效果最好,可作为圆叶唇柱苣苔组织快繁的培养基;不添加激素的MS培养均不发生增殖,生根效果均较好,其中1/10MS可作为圆叶唇柱苣苔的离体保存培养基。     

罗非鱼肾脏细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植法，对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的肾脏组织细胞进行原代培养，建立了罗非鱼肾脏细胞系，已稳定传代培养50代以上，命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞，其最佳培养基为DMEM，最适培养温度为28℃，最适血清浓度为15%。在最适培养条件下，罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏，经台盼蓝染色，约（89.84±3.48）%的细胞具有活性，复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示，第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20~66之间，众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞，可产生典型的细胞病变效应，表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。     

一株湖北源大口黑鲈蛙病毒的分离鉴定

采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 10^8.36±0.15 TCID₅₀/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 10^8.0 TCID₅₀/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。     

鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus, CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L, Betaine0.7 mol/L, Mg~(2+) 8.0 mmol/L, dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍; CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。     

基于SPOT/VGT NDVI的大区域农作物空间分布

随着遥感技术在农业上的广泛应用，及时准确掌握小区域农作物长势和分布的方法相对成熟，但对于省级以上的大区域而言，进行作物遥感测量涉及数据、耗费时间和经费等问题，而中国的农业普查制度又存在时效性的问题。以江苏省为研究区，利用SPOT/VGT NDVI长时间序列数据作为农作物分布研究的底图，分别与研究区农业普查数据和野外调查样方数据进行农作物空间分布的统计回归分析和对比，结果表明：对于大区域而言，SPOT/VGT NDVI长时间序列数据对农业作物生长期特征监测有较好地反应，其逐旬的时间分辨率可以弥补空间分辨率的不足，可有效地对农作物长势进行动态监测；农业普查数据、野外调查样方与SPOT/VGT NDVI时间序列分类结果结合进行回归分析，基本可以满足空间分布情况的调查研究，相对于遥感分类法和传统抽样调查等方式，该方法可以高效率低成本地掌握大区域农作物空间分布情况。