类乌齐牦牛EGLN1基因克隆、生物信息学分析及差异表达

为了对牦牛egl-9家族缺氧诱导因子1 (EGLN1)基因的CDS区核苷酸序列进行克隆,预测其编码的蛋白结构和功能,并分析其在牦牛和黄牛心脏、肺脏、肝脏及大脑等器官中的表达差异,试验根据GenBank中公布的黄牛EGLN1基因mRNA序列设计特异性引物,运用RT-PCR技术获取牦牛EGLN1基因的cDNA序列,对牦牛EGLN1基因CDS区核苷酸序列与蛋白质结构进行生物信息学分析,并构建系统进化树,利用荧光定量PCR技术检测黄牛和牦牛心脏、肺脏、肝脏、大脑中EGLN1基因的相对表达水平。结果表明:牦牛EGLN1基因CDS区序列长度为1 263 bp,编码420个氨基酸;EGLN1的半衰期为30 h,属于碱性蛋白,表现为亲水性,无信号肽及跨膜结构;磷酸化位点共30个,存在3个低复杂区域和1个P4Hc结构功能域;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角构成。牦牛和其他9种动物EGLN1基因序列构建系统进化树中,牦牛与水牛亲缘关系最近,同源性高达99.3%,与褐家鼠亲缘关系较远。EGLN1基因在黄牛和牦牛肝脏、大脑、心脏、肺脏4个器官中均有表达,表达量依次递减;EGLN1基因在牦牛各器官中的相对表达量均显著高于黄牛(P0.05),其中牦牛肝脏中的相对表达量约为黄牛的5.5倍。说明EGLN1基因可作为牦牛低氧适应性研究的重要基因之一。     

CAPN1和CAST基因在牦牛不同组织中的表达差异研究

为检测钙蛋白酶基因(CAPN1)和钙蛋白酶抑制基因(CAST)在牦牛心、肝、脾、肺、肾、胃、眼肌、腹肌等不同组织中的表达水平,采用实时荧光定量PCR技术分析这2个基因的表达规律。结果显示,CAPN1和CAST基因在牦牛的8种组织中均有表达,但在不同组织的表达量存在差异。CAPN1基因在眼肌中的表达量最高,其次为腹肌,在肌肉中的表达量显著高于内脏组织,内脏组织中,在肝脏的表达量最高,其次为肾脏,胃中的表达量最低;CAST基因在胃中的表达量最高,其次为眼肌、腹肌,在肾脏中的表达量最低。     

牦牛肌钙蛋白Ⅰ基因家族的克隆及组织表达分析

为了克隆TNNI基因家族,预测其蛋白结构和功能,并分析其在牦牛不同组织中的表达差异,以0.5岁健康的类乌齐牦牛为试验材料,采用RT-PCR技术克隆牦牛肌钙蛋白Ⅰ基因家族的CDS区序列并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术检测TNNI基因家族各成员的mRNA表达水平。结果表明,TNNI1、TNNI2和TNNI3基因CDS区大小分别为564,549,639 bp,分别编码187,182,212个氨基酸残基。预测分析结果显示:TNNI基因家族编码的蛋白质均为偏碱性蛋白,蛋白结构不稳定,均无跨膜结构域,无信号肽,属非分泌型蛋白;二、三级结构均以α-螺旋为主,均含有肌蛋白超家族保守结构域。系统进化树分析表明:类乌齐牦牛TNNI1基因与水牛的亲缘关系最近,其次是绵羊、黄牛,与小鼠亲缘关系最远;TNNI2和TNNI3均与黄牛、水牛的亲缘关系较近,与其他亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果显示,TNNI1和TNNI2基因在臀肌中的相对表达量最高,且TNNI1基因在心脏、肝脏和肺脏中的表达量显著高于TNNI2基因(P0.05),TNNI3基因在心脏中表达量较高,而在肺脏、臀肌和肝脏中表达量低。     

牦牛与普通牛、水牛的X染色体基因编码区比较及密码子偏性分析

【目的】 从基因组比对及密码子偏性角度分析牦牛与其他牛亚科动物X染色体,有助于了解牦牛品种差异及系统进化地位,为其适应高原低压低氧环境和密码子优化提供参考。【方法】 以牦牛X染色体参考基因编码区序列为参考,与普通牛和江河型水牛X染色体参考基因编码区序列进行基因组比对和基因共线性分析,同时进行基因注释,对过滤后的编码区文件进行相对同义密码子使用频率（RSCU）、ENC-plot、PR2-plot和最优密码子确定等偏性分析。【结果】 在牦牛X染色体基因编码区发现了参与气管收缩、肺部呼吸及机体代谢等基因与普通牛和水牛存在差异,如KLHL13、CENPI和PGK1等基因;共线性显示长段由强选择压和突变压下表现出的交换线性区域;密码子分析中3种牛亚科动物密码子使用偏性相似,偏性均较弱,均偏向G/C结尾;强偏性密码子（RSCU≥1.5）均为CUG、GUG、AGA、AGG和UGA;牦牛、普通牛和水牛分别筛选出16、13和9个最优密码子,均以A/U结尾。【结论】 牦牛与普通牛、水牛相比面临了更大的选择压力,累计的变异程度更大,三者的密码子偏性受到自然选择作用均大于突变作用。研究结果为牦牛的遗传育种、密码子优化和遗传资源开发利用提供参考。     

三个类群藏系绵羊线粒体细胞色素b基因序列多态性及其系统进化的研究

为研究藏系绵羊红原、贾洛、欧拉3个类群的亲缘关系、遗传多样性以及其系统进化,测定该3个类群藏系绵羊的41个个体的细胞色素b基因的全序列。结果表明,41个藏系绵羊的细胞色素b基因的全序列长度均为1 140bp,有27个多态位点,其中单一多态位点16个,简约信息位点11个,共定义13种单倍型,单倍型多样性为0.672±0.078,核苷酸多样性为0.331%。藏系绵羊贾洛类群与欧拉类群遗传距离最远,为0.003 9,红原类群与欧拉类群遗传距离较近,为0.002 64。说明红原类群与欧拉类群亲缘关系较近,藏系绵羊有一个共同祖先,同时存在第2个母系起源。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

黄牛、牦牛和犏牛b-Sycp2基因的克隆 与睾丸组织mRNA的表达水平

【目的】克隆黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,了解牛Sycp2基因序列特征和组织表达特征,分析睾丸组织中Sycp2基因的表达水平。【方法】采用电子克隆和克隆测序技术获得黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析牛Sycp2基因的组织表达特征;采用real-time PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Sycp2基因的表达水平。【结果】①黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因编码区序列全长均为4 365 bp,命名为b-Sycp2,编码蛋白含有1 454个氨基酸残基,并包含卷曲螺旋结构域等典型结构域;②b-Sycp2基因在睾丸组织中特异表达,黄牛和牦牛睾丸组织中b-Sycp2基因的表达水平显著高于犏牛（P＜0.05）。【结论】成功克隆了b-Sycp2基因,b-Sycp2基因为睾丸组织的特异表达基因,且黄牛和牦牛睾丸组织b-Sycp2基因表达水平显著高于犏牛。     

麦洼牦牛肥胖基因部分片段的克隆测序研究

根据普通牛和其他哺乳动物基因的碱基序列以及相关文献资料设计引物，用PCR扩增并测定了牦牛OB基因的部分序列。结果表明：OB基因片段(1820bp)包括内含子2全部，外显子2～3的一部分。通过GenBank中的Blastn序列比较分析，牦牛的OB基因与普通牛种同源性高达98％。这为开展牦牛功能基因组计划和分子育种提供了科学的理论依据。     

麦洼牦牛的RAPD分析

用60个10碱基的随机引物对麦洼牦牛的基因组DNA进行了PCR扩增。有7个引物扩增出了清晰且具多态性的条带，条带总数为34，其中有25条为可变条带，表现出多态性，多态频率为74％。根据Shannon公式计算出的7个引物扩增带频率的群体遗传多样性指数分别为：1．7955（OPA10）、0．6726（OPA13）、0．5433（OPB07）、0．0739（OPB10）、0．9919（OPA04）、1．4015（OPC06）、1．4514（OPK12），平均为：0．99，其平均百分比差异均值（MAPD）为40．41％。