控制环境养殖下近交对中国对虾早期体重和抗WSSV性状的影响

过量的捕捞和不合理的人工育种措施，使中国对虾野生和养殖群体的遗传多样性均遭到不同程度的降低。本试验在相似的环境条件下养殖了40个野生对虾产生的家系和3个兄妹交产生的家系，定量测定了平均体重(1.43~1.58) g 1 460尾中国对虾早期体重和感染白斑综合征病毒（WSSV）后存活时间的近交衰退系数。结果显示，野生对虾家系组的平均体重和平均存活时间分别为(1.58±0.01) g和(100.43±0.68) h，而兄妹交家系组平均体重和平均存活时间分别是(1.43±0.04) g和(85.84±1.70) h，平均体重和平均存活时间在两组间均存在极显著差异（P<0.01）。野生对虾家系组体重和存活时间的表型相关系数为0.16±0.00，而兄妹交家系组两者间的表型相关系数为0.20±0.00，但是两组间表型相关系数差异不显著（P>0.05）。近交系数每增加10％，体重和感染WSSV后存活时间分别衰退-3.80%±0.17%和-5.81%±0.11%，与近交能够降低生长和疾病抗性的观点相一致。实验结果表明，在选择育种和种质资源保护过程中都应该保证基础群体遗传背景最大化，从而有效控制近交。图0表2参39     

凡纳滨对虾感染白斑综合症病毒后的新症状

2007年6-7月,辽宁营口地区凡纳滨对虾养殖场陆续出现死虾现象,通过组织病理观察和PcR检测,确定为白斑综合症.患病初期,对虾并未表现出典型白斑、甲壳易剥离等症状,而在鳃区头胸甲内侧滋生一种囊状胶状物,导致头胸甲内侧肿胀,病理观察发现该滋生物为对虾感染白斑综合症病毒后,皮下组织"胶质化"的结果,同时胃和皮下组织的结缔组织中有大量的典型性病变核;细菌分离结果显示,伴随着弧菌和假单胞菌的混合感染.     

3种市售养殖对虾白斑综合征病毒(WSSV)的核酸探针检测

对虾白斑综合征病毒是对虾养殖业危害最为严重的病毒, 每年给对虾养殖造成很大经济损失, 已成为对虾养殖业可持续发展的严重障碍。在过去的十几年中, 人们采取各种方法防止白斑综合征病毒的传播。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis )、凡纳滨对虾( Litopenae vannamei)、日本囊对虾(Marsup enaeus jap onicus)是我国主要的对虾养殖品种, 也是白斑综合征病毒的敏感宿主。按照煮沸- 乙醇沉淀法快速、简便提取市售30 只中国明对虾、28只凡纳滨对虾、29只日本囊对虾DNA, 然后用地高辛标记的核酸探针进行斑点杂交检测白斑综合征病毒,从而了解市场中养殖对虾携带白斑综合征病毒的情况。检测结果显示, 所有样品均未感染白斑综合征病毒, 说明目前白斑综合征病毒在一定程度上得到了有效控制。     

双重PCR同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)

根据Genbank中对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列，设计了两对能分别检测WSSV和IHHNV保守片段基因的特异性引物，而且这两对引物在同一反应体系中可以同时对WSSV和IHHNV的DNA模板进行多重PCR扩增，得到大小分别为110bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的扩增条带。对影响PCR反应的主要因素Mg“浓度和退火温度进行了优化，证明当Mg^2＋浓度为2．0～4．0mmd，退火温度为57～59℃时可获得最佳的扩增和检测效果。特异性试验结果表明，这两对引物检测WSSV和IHHNV具有很好的特异性，对其它对虾常见病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该反应体系最低能检测100pg的WSSV和IHHNV的DNA模板。临床检测表明，所建立的双重PCR方法可以适用于WSSV和IHHNV的同时检测和鉴别。     

乳糖诱导对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28基因在重组大肠杆菌中的表达

以含对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）囊膜蛋白VP28编码基因质粒的重组大肠杆菌Escherichia coliB121作为研究对象，研究了乳糖或乳清粉代替IPTG作为诱导剂诱导重组囊膜蛋白VP28的表达。结果表明，乳糖不仅能够作为诱导剂诱导重组大肠杆菌进行外源蛋白的表达，而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化，乳糖在发酵培养基的添加量为8g·L^-1，发酵时间为12h时可以获得最高的目的蛋白表达量，为97．36mg·L^-1。试验亦使用乳清粉作为发酵培养基的碳源和诱导工程菌表达的诱导剂。结果表明，在发酵培养基中添加乳清粉作为碳源和诱导剂，使其乳糖终浓度为10g·L^-1，发酵时问为13h时可以获得最高的目的蛋白表达量，为86．24mg·L^-1。     

Effect of low water temperature on viral replication of white spot syndrome virus in Procambarus clarkii

This study evaluated the effect of low water temperature (10 ± 1 °C) on viral infection and replication of white spot syndrome virus (WSSV) in crayfish, Procambarus clarkii, under standardized conditions. Crayfish were (i) maintained at 24 ± 1 °C before challenge and 10 ± 1 °C afterwards, or (ii) maintained at 10 ± 1 °C before challenge and 24 ± 1 °C afterwards. No mortality was observed when crayfish were held at 10 ± 1 °C after challenge, but mortality reached 100% when they were transferred to 24 ± 1 °C. Competitive PCR showed that viral levels at 10 ± 1 °C rose from 10⁶ to 10⁸ copies/mg of gill tissues, while at 24 ± 1 °C levels increased from 10⁶ to 10¹⁰ copies/mg of gill tissues during the same time interval. These results showed that a low water temperature of 10 ± 1 °C could reduce viral replication when compared to 24 ± 1 °C but could not prevent it.     

两个对虾新型表达载体的构建

【目的】构建一种能在对虾细胞内稳定存在的新型表达载体,为对虾口服疫苗的研制奠定基础。【方法】设计特异性引物,以对虾白斑综合症病毒（WSSV）DNA为模板,PCR扩增早期基因启动子IE1的不同长度片段IE（-94/＋52）和IE（-945/＋52）;利用限制性酶切及连接的方法,以IE（-94/＋52）和IE（-945/＋52）替换pcDNA3.1-GFP的CMV启动子;然后将构建好的表达载体与阳离子脂质体转染试剂TransLipidTM混合,肌肉注射凡纳滨对虾。【结果】经双酶切鉴定,表达载体pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP分别获得6150和146 bp、6150和997 bp的目的条带;注射pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP的对虾部分体细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,且注射pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP的绿色荧光强度强于注射pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP。【结论】构建的两个新型表达载体pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP均可用于对虾病毒抗原蛋白基因的表达。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

池养罗氏沼虾生长缓慢原因初步分析

通过调查分析池养罗氏沼虾的生长状况、主要病原感染情况、遗传多样性、水质以及感染WSSV罗氏沼虾生长存活试验,探讨池养罗氏沼虾生长缓慢原因。结果表明:2016年生长正常与生长欠佳两类池塘平均有效等位基因介于0.632 2~0.687 2之间,平均多态信息含量介于0.583 1~0.635 4之间,属于高度多态性,两种生长类型池塘罗氏沼虾各遗传参数指标和水质指标间均无显著性差异(P0.05);生长正常池塘罗氏沼虾在养殖50、100和150 d,体长、体质量等指标均显著高于生长欠佳池塘罗氏沼虾(P0.05),EHP、WSSV和IHHNV阳性检出率均显著低于生长欠佳池塘(P0.05),养殖220 d,两类池塘各生长状况指标无显著性差异(P0.05),两类池塘沼虾携带上述病原的阳性检出率显著高于前3次检疫结果(P0.05),同时生长正常池塘阳性检出率更高,雄虾数量更少,与2014、2015年调查塘干塘起捕前结果类似;人工感染WSSV罗氏沼虾,感染15、30和45 d,各浓度组生长状况指标存在显著性差异(P0.05),各生长状况指标均随着感染浓度的上升逐步降低。据此结合养殖中后期每隔10 d左右捕大留小的生产工艺,认为水质、种质差异或退化引起池塘罗氏沼虾生长缓慢可能性很小,而感染特定病原引起罗氏沼虾生长缓慢的可能性较大,且感染特定病原对雄虾生长的影响可能大于雌虾。     

5种饵料对日本囊对虾早期生长及感染WSSV存活率的影响

采用人工配合饲料、鱼粉、丰年虫无节幼体、虾片和牡蛎肉5种不同饵料投喂日本囊对虾幼虾,实验周期20d,测量日本囊对虾的体长、体重及计算其成活率。结果表明,5种饵料对日本囊对虾生长的影响差异显著（P〈0.05）,其中丰年虫组体长、体重的增长明显优于其他各组,差异达极显著水平（P〈0.01）,牡蛎肉组次之,配合饲料组的体长、体重增长最小,鱼粉组体长、体重增长大于虾片组。人工投喂WSSV感染5种不同饵料投喂的日本囊对虾幼虾,实验周期10d。丰年虫组和鱼粉组的存活率最高,明显高于配合饲料和牡蛎肉两实验组,差异达极显著水平（P〈0.01）;丰年虫组和鱼粉组之间存活率无显著差异（P〉0.05）,人工配合饵料组和牡蛎肉组差异不显著（P〉0.05）。半定量PCR检测表明,感染前日本囊对虾幼虾均不携带WSSV,感染后全部个体均检测到相应的病毒特征片段。