GDS-80手持基因枪在橡胶树遗传转化上应用的参数优化与配件改进

GDS-80手持基因枪是美国Wealtec公司2009年推出的基因传递系统,具有操作简便、高效的特点。已报道的橡胶树基因枪转化研究都是使用台式基因枪。本文首先利用考马斯亮蓝轰击滤纸去除明显不适合的参数,接着以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,轰击巴西橡胶树体细胞胚以及愈伤组织,用荧光显微镜观察绿色荧光,探究适合橡胶树的轰击参数。而且比较了Image J软件和肉眼统计荧光斑点数及GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪的差异。结果表明：对于橡胶树体细胞胚和愈伤组织,仅依靠原厂配件难以获得较好的转化效果。本文设计了直径3 cm（与轰击范围相同）,高度2.5 cm,孔径60目的过滤网。同时改进装试验材料的培养皿,用刀片在培养皿的中心割出一个直径3 cm的圆圈,轰击胚状体时,将上述设计的过滤筛网正向卡在圆圈上,胚状体放入过滤网中,轰击时将培养皿用试管架架高,压力就从筛网及底部的空洞分解,微弹完全轰击到试验材料。轰击胚状体最优参数为：轰击压力为60 psi,针状调节阀为3圈,目标间隔盘为6 cm。轰击愈伤时将材料放到普通培养皿中心的轰击范围内,反向盖上过滤筛网。最优轰击参数为：轰击压力为50 psi,针状调节阀为4圈,目标间隔盘为6 cm。本文采用Image J软件进行荧光斑点计数,准确率与肉眼相当,但较肉眼省时。GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪转化效率相当,但GDS-80手持基因枪每打一枪比PDS-1000/He台式基因枪快12 min。研究结果为橡胶树遗传转化提供了高效的基因枪转化体系,为转基因研究提供了一个高效的统计荧光数的软件。     

利用EST-SSRs标记分析巴西橡胶树魏克汉种质的遗传多样性及遗传分化

橡胶树魏克汉(Wickham)种质是指1976年英国人魏克汉在亚马逊河下游与塔帕若斯(Tapajos)河汇合处的博因(Boim)采集并培育46株母树繁殖的后代中选出的初生代及其后杂交的次生代至多生代栽培品种。本研究利用25对EST-SSRs引物,对中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃中保存的来自6个国家的278份魏克汉种质进行遗传多样性和遗传分化分析。种质总群体共检测出等位变异103个,平均等位基因数(Na)4.12个,稀有等位基因占全部等位基因的14.56%;平均期望杂合度(He)值和Nei平均多样性指数(H)值分别为0.4108和0.4100;聚类分析得到种质个体间的遗传距离(GD)为0~1.1632。不同国家种质群体间的遗传多样性指数(H)值:巴西斯里兰卡印度尼西亚中国马来西亚泰国,但经SPSS非参数检验表明6个国家群体之间的种质遗传多样性水平差异并不显著;不同国家种质群体间的遗传一致度(GI)为0.9812~0.9869,与中国种质的亲缘关系最近的是印度尼西亚、其次马来西亚、泰国、斯里兰卡、巴西;仅3%的遗传变异来源于不同国家种质群体间,不同国家种质间的平均基因流(Nm)为4.463,大而通畅的基因流是橡胶树6个国家群体间遗传分化水平很低的主要原因。研究结果表明,中国国家橡胶树种质资源圃保存的魏克汉种质的遗传多样性较差,但通过EST-SSRs可检测到丰富的稀有等位基因。虽然不同国家种质交流频繁,导致种质之间和不同国家来源种质之间遗传距离非常近,但是,种质之间和不同国家来源种质之间依然存在一定的遗传分化,特别是巴西种质与中国种质遗传距离最远,基因流最小,遗传多样性最为丰富。     

巴西橡胶树HbRD22基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术从低温诱导的巴西橡胶树全长cDNA文库中获得了HbRD22基因,该基因全长1 458 bp。生物信息学分析结果表明,HbRD22编码一个由338个氨基酸组成的、相对分子量为36.96 ku、等电点为7.65的多肽,并含有一个由217个氨基酸组成的BURP结构域。其推导的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达69%。信号肽预测结果表明HbRD22蛋白为分泌型蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽区域。Northern blotting分析结果表明,该基因在正常生长情况下,表达水平较高,干旱胁迫后24 h,表达量逐渐减低,直至检测不到,揭示该基因受干旱胁迫负调控。     

橡胶树热研8-79原生质体培养再生植株

[目的]优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础.[方法]以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率.[结果]酶组合为纤维素酶1.50%+果胶酶0.15%+离析酶0.50%、酶解时间为12h时,继代培养第5d的胚性悬浮细胞达最高产量(3.6 ×107个/mL PCV);用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%.原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株.[结论]通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系.     

巴西橡胶树专利现状分析

从时间、研究领域、申请人地域分布3个方面对巴西橡胶树全球以及中国专利申请数据进行分析,并从时间、研究领域、申请人类型3方面对国内发明专利申请情况再次进行分析。结果发现：全球以及中国专利申请量虽波动起伏,但整体呈上升趋势,且主要集中在植物保护和农业生物技术领域;中国发明专利的国内申请人主要为科研单位且集中在植物保护、农业生物技术和农产品加工领域;国外申请人主要为企业且集中在植物保护领域。分析结果为中国天然橡胶产业发展政策的制定提供数据参考。     

启动子陷阱技术在植物启动子克隆研究中的应用

影响消费者选择购买场所的因素是多样的,涉及到消费者的个性因素和购物选择因素。运用Probit模型进行回归分析后,可以看出,对于不同类型的购买场所来说,不同因素的影响程度表现出明显的差异性。个性特征因素对超市和大型农贸市场的影响比其他2类购买场所的影响更大,购买选择因素除了购买时间因素在4种购买场所中表现出倾向一致外,其他因素影响的显著性表现出很大差异性,说明在分析消费者购买热带农产品地点选择的倾向性时,进行类型细分研究的重要性。     

巴西橡胶树乙醇酸氧化酶HbGOX1基因的鉴定与表达分析

光呼吸途径是植物中重要的反应途径,它通过消耗光合作用产物影响作物的产量。乙醇酸氧化酶是该途径的关键调控酶,在橡胶树中尚未见研究报道。本研究分离和鉴定橡胶树HbGOX1基因的全长cDNA序列,对其编码的蛋白质进行生物信息学分析,并通过qPCR技术进一步研究HbGOX1基因在低温胁迫下的表达情况。结果发现,该基因受低温胁迫负调控。此结果为进一步揭示橡胶树光呼吸途径在橡胶合成中的作用奠定了基础。     

拟南芥突变体L1.3的表型分析及遗传定位

本研究在转橡胶树Hb CBF1基因的拟南芥后代中,发现了一株矮小突变体。对其进行表型观察,发现突变体叶片颜色为深绿色、叶片椭圆、根系不发达、植株极度矮化、营养生长和生殖生长周期延长。通过基因组重测序技术对该突变体的遗传位点进行了定位,发现Hb CBF1基因的插入破坏了BRI1基因的编码,进而引起突变。通过实时荧光定量PCR对突变体中细胞周期相关基因CDKA、CDKB、CYCB1-1、CYCD3-1的表达量进行分析,发现这些基因的表达量显著低于野生型,推测BRI1基因的突变阻碍了细胞有丝分裂,从而造成矮化等表型。     

橡胶树优良无性系热研8-79割胶制度研究初报

研究不同割胶制度对橡胶树优良无性系热研8-79幼龄树的产量、干含及蔗糖、硫醇、无机磷、镁离子等指标的影响。认为在热研8-79投产初期应以低浓度乙烯利刺激为宜,采用S/2d/4+ET0.25％割制具有产量高、蔗糖及硫醇含量高、胶乳稳定性增强的优势。指出对该品种采用低频、低浓度刺激的同时必须结合提高生产管理水平,从而达到高产、高效、安全的目的。     

橡胶树次生体胚发生及其再生植株遗传稳定性的分子检测

以热研7-33-97花药为材料,建立橡胶树次生体胚发生和植株再生体系,主要包括初生花药体胚诱导、次生体胚发生和次生胚植株再生三个步骤.结果表明,来自花药初生异常胚和初生子叶期胚的0.2～0.3 cm胚块均能成功诱导次生体胚发生,并均能获得成熟子叶期胚.以初生异常胚为外植体,每个胚块获得子叶期胚数为0.64个.以初生子叶期胚为外植体连续3次诱导次生体胚发生,随诱导次数增加,体胚发生频率先上升,后保持稳定.2,4-D对次生体胚植株再生具有明显影响.添加4.5 μmol/L和9 μmol/L 2,4-D植株再生培养基中植株再生频率达到85.0%.AYLP检测次生体胚植株遗传稳定结果显示:(1)来自初生异常胚的次生体胚植株60.0%植株DNA发生变异;(2)来自初生子叶期胚的次生体胚植株,随次生体胚发生次数增加,检测到DNA变异植株频率由30.0%升高到52.4%.AFLP聚类分析结果显示,次生体胚植株与热研7-33-97高度相似,相似系数大于0.904.