南极鱼Ⅲ型抗冻基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

为了探讨多聚AFPⅢ的作用机制,从南极鱼Lycodichthys dearborni的多聚三型抗冻蛋白基因LD12 cDNA中克隆得到AFPⅢ的四聚体,命名为LD4,并构建真核表达质粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。将表达质粒转染到斑马鱼细胞系ZF4中,发现LD4可以在ZF4中大量表达并且能够减少斑马鱼细胞在低温胁迫下的死亡率。通过对不同处理温度(28、18、10 ℃)下的WT、EGFP和LD4细胞进行转录组测序分析,找出26个表达差异转录因子,其中I3MB13、ZNF687b等表达上调,JUN、Cremb等表达下调,并且通过荧光定量PCR的验证。通过KEGG pathway分析发现,这些差异性基因主要参与细胞凋亡、细胞周期、增殖等调节通路。采用 Annexin V-PE/7-AAD双染色法对3种不同温度下的WT、EGFP和LD4细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,LD4在低温下与对照组相比凋亡率没有显著差异,说明LD4可能是通过其他通路而不是通过抑制细胞凋亡来抵御低温胁迫,这为LD4作用机制的进一步研究提供了理论基础。     

日本文昌鱼雄性高表达miRNA的筛选与鉴定

MicroRNA(miRNA)是真核生物中长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA,在基因表达调控中扮演重要角色。雌雄差异miRNA的筛选将有助于研究性腺发育的分子机制。通过分离日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)精巢和卵巢的小RNA,利用miRNA芯片杂交的方法,从文昌鱼的小RNA文库中筛选出36个日本文昌鱼性腺高表达的miRNA,其中11个miRNA在文昌鱼精卵巢中呈显著差异表达。6个文昌鱼特有的miRNA(bfl-miR-92b,bfl-miR-10A06,bfl-miR-281,bfl-miR-36B03,bfl-miR-29B02和bfl-miR-26A01)在雌雄性腺中呈现差异表达,其中4个miRNA为雄性高表达,2个miRNA为雌性高表达。利用RT-qPCR验证了bfl-miR-92b,bfl-miR-10A06,bfl-miR-281和bfl-miR-36B03这4个文昌鱼特有的miRNA在精巢中的丰富表达。这些研究结果为文昌鱼雌雄差异miRNA的功能研究奠定了重要基础。     

雌雄罗非鱼对持续性高温的响应机制

为探究不同性别尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）对持续性高温生境的响应,持续监测36℃实验组和28℃对照组的雌鱼和雄鱼的形态学特征变化,并取处理70 d的罗非鱼脑、背部肌肉和鳃组织进行TUNEL染色法分析,选取该实验组和常温对照组个体的背部肌肉进行转录组测序。结果显示：高温处理组的生长发育速度明显迟缓于对照组,雄鱼生长发育比雌鱼快;TUNEL染色法显示在背部肌肉组织中凋亡信号最强,而在其他组织中信号较弱;在高温处理后的雌鱼和雄鱼中分别鉴定出3 405个和4 645个差异表达基因,上调基因均多于下调基因。对这些差异表达基因的KEGG通路聚类分析发现,雌鱼主要涉及细胞周期、嘌呤代谢和DNA复制等通路,雄鱼在心肌细胞的肾上腺素信号传导、心肌收缩和紧密连接等通路显著富集。这些结果为研究不同性别罗非鱼对高温环境的适应机制提供了分子生物学的基础信息。     

逆转座子LINE1在Hela细胞中的表达及转录组分析

为研究逆转座子LINE1(简称为L1)在Hela细胞内的作用机制,对转染L1的Hela细胞和正常细胞进行转录组测序,通过对转录组数据进行拼接组装,对差异表达基因进行了生物信息学分析。结果表明:试验共筛选出391个差异表达基因,其中45.6%的差异表达基因显著性上调,这些基因通过GO分类注释,可分为14类;通过KEGG对差异基因进行通路富集,表明差异基因主要富集在破骨细胞分化、色氨酸代谢、乙型肝炎、病毒致癌作用和可卡因成瘾等信号通路,发现了一些与细胞黏着连接、表皮相关的基因有差异性表达。研究表明,通过转录组测序,获得了丰富的关于L1在Hela细胞中表达的信息,为进一步研究L1在细胞中的作用机制供了思路和理论依据。     

鳞头犬牙南极鱼LeptinB基因在抵御低温应激中的作用

为了探究瘦素基因(LeptinB, LepB)在斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)低温应激中的作用,本研究根据鳞头犬牙南极鱼(Dissostichus mawsoni) LepB基因(DM-LepB)编码的氨基酸序列,克隆到构建的pTOL2-actin-EGFP质粒中(启动子为斑马鱼的β-actin)。选取EcoRⅠ和BamHⅠ为限制酶,设计构建了pTOL2-LepB+HIS-EGFP表达载体,并转染至ZFL细胞中。选择致死温度10 ℃进行实验,采用流式细胞术检测了低温胁迫下细胞的存活率,使用增强型CCK-8试剂盒检测了低温条件下细胞的生长增殖情况,使用荧光探针DHE检测了细胞活性氧(ROS)含量。结果显示,LepB基因的过表达能有效减少细胞ROS的产生,减轻细胞凋亡以应对低温胁迫。分析还显示,DM-LepB的过表达也有利于维持低温刺激下的胞内ATP水平与线粒体状态,有效减轻低温刺激对细胞的凋亡和坏死作用,对细胞冷应激起到保护作用。采用油红O染色和甘油三酯(TG)实验检测发现,DM-LepB基因能减缓低温刺激时细胞脂质的消耗,较多的脂质保留可减弱低温刺激对细胞的伤害,使得细胞能更好地抵抗低温损害。研究结果为揭示南极鱼类的低温适应分子机制提供了基础资料。     

鳞头犬牙南极鱼atp6v0c基因在HeLa细胞中抗寒功能的研究

为探求南极鱼ATP酶类在低温适应下的作用,从鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawsoni的c DNA文库中克隆atp6v0c基因(dmatp6v0c),并转染到He La细胞中,通过流式细胞仪检测细胞在低温胁迫下(10℃)的死亡率,获得了dmatp6v0c基因的全部编码序列,其长度为462 bp,并将其插入到真核表达载体pc DNA3.1(-)上用于体外表达。结果表明,与对照组相比,在低温胁迫下,过表达dmatp6v0c基因的He La细胞死亡率从(19.23±1.87)%显著降低到(8.13±0.04)%(P0.05)。研究表明,在低温胁迫下dmatp6v0c基因过表达能显著降低He La细胞的死亡率,试验结果可为dmatp6v0c基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供理论依据。