DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响

为揭示盘状结构域受体1（discoidin domain receptor1,DDR1）基因对水牛泌乳性能的影响,本研究构建了水牛DDR1基因真核表达载体,并对其最佳转染时间进行摸索,同时分析DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,载体片段大小与目标载体片段大小一致,均为8.8 kb,测序结果显示其与目的片段序列匹配率为100%。细胞转染试验结果显示,DDR1基因过表达最佳转染时间为48 h。细胞增殖检测结果显示,DDR1基因过表达组与对照组细胞相对荧光值差异不显著（P>0.05）。细胞凋亡检测结果显示,DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的晚期凋亡率（19.87% VS 17.49%）无影响（P>0.05）,但极显著增加了水牛乳腺上皮细胞早期凋亡率（6.48% VS 1.35%,P<0.01）。同时,DDR1基因过表达上调了水牛乳腺上皮细胞中抑凋亡基因BCL-2和XIAP的表达,而下调了促凋亡基因P53的表达。此外,DDR1基因过表达显著提高了水牛乳腺上皮细胞的迁移率（66.26% VS 58.76%,P<0.05）。综上,试验成功构建了水牛DDR1基因真核表达载体并证明了DDR1基因过表达促进了水牛乳腺上皮细胞的早期凋亡和迁移,为今后进一步研究水牛乳腺发育和泌乳性能提供了一定理论依据。     

腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎条件的摸索

试验旨在探究腺病毒感染水牛颗粒细胞和胚胎的最佳条件,以提高转基因水牛胚胎的生产效率。以水牛颗粒细胞和体外发育的胚胎为研究对象,分别用0、1×10~0、1×10~(-1)、1×10~(-2)、1×10~(-3)、1×10~(-4)、1×10~(-5) GFU/mL腺病毒感染水牛颗粒细胞,获得最佳感染浓度后,在最佳浓度条件下分别感染24、48、72、96 h,摸索最佳感染时间,用倒置荧光显微镜观察试验结果。利用腺病毒感染水牛颗粒细胞的最佳浓度和时间分别感染2细胞和4细胞期胚胎,对胚胎的最佳感染条件进行摸索,分析胚胎分裂率、囊胚率和转染囊胚率。结果显示,1×10~(-2) GFU/mL浓度和48 h感染时间可获得水牛颗粒细胞的最佳腺病毒感染效率。腺病毒感染2细胞和4细胞期无透明带和非完整透明带胚胎后胚胎发绿光,而感染完整透明带胚胎后不发光,2细胞期胚胎感染后停止发育,4细胞期开始感染的非完整透明带胚胎可继续发育至囊胚。于4细胞期分别感染完整透明带组、非完整透明带组和无透明带组水牛胚胎,结果显示,非完整透明带转染组在囊胚率和囊胚转染效率上均优于其他组。综上,非完整透明带,1×10~(-2) GFU/mL和48 h为感染浓度和时间,4细胞期为感染起始期的腺病毒介导的水牛转基因胚胎生产方法能够实现目标基因在水牛胚胎中的高效表达,从而达到提高转基因水牛胚胎生产效率的目的。     

奶水牛固醇携带蛋白2基因克隆、生物信息学分析及其组织表达检测

本研究旨在对水牛固醇携带蛋白2（sterol carrier protein 2,SCP2）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在水牛不同组织中的表达。以黄牛SCP2基因（登录号：NM_001033990.3）为种子序列成功克隆了水牛SCP2基因完整CDS区,该序列长1 632 bp,可编码543个氨基酸;其与黄牛、绵羊、山羊、白鲸、人、家犬和家猫的同源性分别为95.9%、93.4%、92.4%、89.4%、88.3%、86.3%和86.9%,说明SCP2基因CDS区在不同物种间具有较高的保守性。聚类分析则表明水牛与黄牛的分子进化关系最近;氨基酸序列分析表明,SCP2蛋白的分子式为C₂₆₀₂H₄₁₃₁N₇₀₉O₇₇₄S₂₉₈,分子质量为58.66 ku,理论等电点（pI）为8.59,不稳定系数为27.94,平均亲水性为-0.215,属于碱性、稳定、亲水蛋白质;二级结构分析表明水牛SCP2蛋白由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,其中α-螺旋占35.54%,无规则卷曲占48.99%,延伸链占15.47%,与三级结构预测结果一致;亚细胞定位分析表明,水牛SCP2蛋白分布在细胞质（43.5%）、过氧化物酶体（21.7%）、线粒体（17.4%）、细胞核（13.0%）和细胞骨架（4.4%）;跨膜结构和信号肽预测分析表明,水牛SCP2蛋白不含跨膜结构和信号肽;磷酸化位点分析发现,水牛SCP2蛋白有13个Ser、3个Thr和2个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点;蛋白质结合位点预测结果显示,水牛SCP2蛋白含有12个蛋白质结合位点和1个多核苷酸结合位点;实时荧光定量PCR结果表明,水牛SCP2基因在肝脏中表达量最高,其他组织中表达量从高到低依次为乳腺、淋巴、肾脏、大肠、胃、肺脏、脾脏、卵巢、垂体、大脑和心脏。本试验为今后进一步探讨SCP2基因的功能奠定了基础。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

SAHA对水牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育潜能的影响

卵母细胞体外成熟过程中组蛋白修饰发生了剧烈的变化,其表达模式的改变对卵母细胞的成熟乃至后续胚胎的发育有着至关重要的作用.去乙酰化酶抑制剂-伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)作为新型抗癌药物,是组蛋白去乙酰化酶的潜在抑制剂,在体内和体外抑制多种类型肿瘤细胞生长并促进其分化和凋亡.为探讨组蛋白去SAHA对水牛Bubalus bubalus)卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0,2,5,10,20和40 nmol/L)SAHA处理成熟期的水牛卵母细胞对其成熟率(第一极体排出率)、受精卵分裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的影响.结果表明,10 nmol/L SAHA处理组成熟率、卵裂率、囊胚率显著高于对照组((77.07±1.79)％和(62.3士2.08)％,(86.81±1.93)％和(74.86±2.07)％,(27.56±2.86)％和(24.23±1.74)％,P＜0.05).随着浓度增加,各处理组囊胚总细胞数有提高的趋势,但组间差异不显著(141±10,151±13,165±17,170±14,147±20,185士22,P＞0.0S).qRT-PCR检测结果显示,SAHA对水牛卵母细胞成熟过程的处理,均显著下调了cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)结合蛋白基因CBP、组蛋白乙酰转移酶1基因(histone acetyltransferases 1,HAT1)、组蛋白去乙酰化酶1基因(histone deacetylase 1,HDAC1)在MⅡ期卵母细胞中的表达,P300则有所上调.实验结果表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理是一种能够提高水牛卵母细胞体外成熟效率促进胚胎发育的有效途径之一,该研究结果可为今后研究转基因克隆胚胎发育相关基因调控机理提供了理论基础.     

水牛FADS2基因的电子克隆及序列分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛Δ6脂肪酸脱氢酶（Δ6-fatty acid desaturases,FADS2）基因进行克隆和生物信息学分析,为探究FADS2基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛FADS2基因序列（GenBank登录号：NM_001083444.1）为探针设计引物,利用电子克隆法克隆水牛FADS2基因,并通过RT-PCR验证,对FADS2基因的序列特征进行生物信息学分析。测序结果表明,水牛FADS2基因序列全长为36 600 bp,由12个外显子和11个内含子组成,包含一个长1 335 bp的开放阅读框,可编码444个氨基酸。序列同源性分析显示,水牛FADS2基因编码序列与牦牛、黄牛、人、猪、家兔、虎鲸和褐家鼠序列的同源性分别为98.88%、98.88%、89.66%、90.79%、90.85%、92.35%和87.11%。蛋白质预测分析表明,水牛FADS2蛋白分子质量为52.51 ku,理论等电点（pI）为8.75,呈弱碱性,属于亲水性蛋白,无信号肽。系统进化树分析结果表明,FADS2基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,其中水牛与牦牛、黄牛亲缘关系较近,与褐家鼠亲缘关系较远。水牛FADS2基因的成功克隆为今后阐明水牛泌乳性能的作用机制奠定了基础。     

水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测

试验旨在对广西本地水牛FSHR基因5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性检测。根据GenBank已公布的黄牛FSHR 5'侧翼序列,本试验设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增FSHR基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析。结果显示本试验成功克隆了广西本地沼泽型水牛FSHR 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2979 bp,同源性比对分析结果表明其与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、猪和人的同源性分别为100%、99%、93%、92%、91%和75%。对其5'侧翼2000 bp序列进行启动子预测及转录因子结合位点预测,结果显示在其翻译起始位点上游-147 bp附近存在TATA box,启动子区存在GATAs、FOXO1、FOXO3、Nobox、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在FSHR启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATAs家族基因结合的情况。水牛FSHR启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞系中的表达,但表达非常微弱;也能启动EGFP在CHO细胞系中表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞系中的强度相似,结果表明水牛FSHR是个强启动子。总之,本研究成功克隆了沼泽型水牛FSHR基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性的转录活性,为后期水牛繁殖性能分子机理阐明及基于卵巢特异性表达外源基因的转基因水牛奠定了基础。     

水牛ABCD基因家族生物信息学分析及ABCD1基因表达研究

为鉴定水牛ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运蛋白D （ABCD）基因家族成员及其在水牛中的表达,本研究利用生物信息学对水牛ABCD基因家族的染色体定位、基因结构、保守结构域、蛋白理化性质进行分析,利用实时荧光定量PCR检测ABCD1基因在水牛各组织及不同泌乳期乳腺中的表达,并用3种激素处理水牛乳腺上皮细胞,检测激素对ABCD1基因表达的影响。结果显示,从水牛全基因组中共鉴定出9个ABCD家族基因,分别为ABCD1、ABCD2、ABCD3、ABCD4,其中ABCD4基因包含6个不同转录本（ABCD4X1-ABCD4X6）,ABCD1~ABCD4 4个基因分别位于X、4、6、11号染色体;序列分析发现,ABCD家族基因包含9~22个内含子,编码444~741个氨基酸,分子质量为49.63~83.41 ku,等电点为6.43~9.64;共找到ABC_membrane_2、Endonuclease_5、ABC_tran 3个ABCD家族基因所共有的功能基序。ABCD基因家族可分为4个亚族,系统进化树显示,ABCD基因高度保守。共线性分析表明,水牛和奶牛之间存在7对直系同源的ABCD家族基因。不同组织定量表达结果表明,ABCD1基因在水牛15个组织中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高。不同泌乳时期的乳腺组织定量表达结果显示,ABCD1基因在50 d表达量达到最高,整个泌乳期呈现低-高-低表达模式。用不同浓度催乳素、雌二醇、孕酮分别处理水牛乳腺细胞,当催乳素、雌二醇和孕酮浓度分别达到2.0、0.3和4.5 μg/mL以上时,ABCD1基因表达量显著高于对照组。结果表明,水牛ABCD基因家族包含9个基因,其中ABCD1基因参与泌乳调控,本研究为进一步探讨ABCD家族基因在水牛乳腺中的功能提供了参考依据。     

水牛PNPLA8基因编码区克隆、表达分析及催乳素对该基因的调节作用

为了探究磷脂酶patatin样域包含蛋白8（patatin-like phospholipase domain containing 8,PNPLA8）在水牛乳腺脂质代谢中的作用,试验根据GenBank中公布的奶牛PNPLA8基因序列（登录号：XM_005205444.4）设计引物,应用PCR扩增并克隆水牛PNPLA8基因编码区（CDS）,应用生物信息学软件分析序列及蛋白质结构;抽提水牛不同组织及不同泌乳期乳腺组织RNA,利用实时荧光定量PCR检测PNPLA8基因在不同组织间和不同泌乳期的表达;利用不同浓度的催乳素处理水牛乳腺上皮细胞,通过定量检测催乳素对PNPLA8基因表达的影响。结果显示,水牛PNPLA8基因CDS长2 355 bp,编码784个氨基酸,与牦牛、山羊等PNPLA8基因具有较高的同源性;PNPLA8基因在所检测的水牛11个组织中有不同水平的表达,在肺脏和乳腺中表达量相对较高,在脂肪和肌肉组织中表达量较低;在整个泌乳期内PNPLA8基因的表达呈现"低-高-低"趋势;催乳素处理水牛乳腺上皮细胞结果显示,随着催乳素浓度升高,PNPLA8基因表达量逐渐下降。本研究成功克隆了水牛PNPLA8基因,并发现PNPLA8基因是参与乳腺泌乳的一个功能基因,为进一步研究PNPLA8基因在水牛乳腺中的功能奠定基础。