PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

解淀粉芽孢杆菌HMB33604的抑菌物质及对马铃薯黑痣病的防治效果

【目的】由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-3）引起的马铃薯黑痣病是马铃薯生产中重要的土传病害,严重影响马铃薯的产量和质量。利用微生物杀菌剂防治马铃薯黑痣病是环境友好、切实可行的措施之一。本研究旨在获得有效防治马铃薯黑痣病的生防细菌并明确其防病作用方式,为生防细菌发酵工艺的优化、微生物杀菌剂的合理施用提供科学依据。【方法】通过对峙培养法和温室盆栽试验筛选有效防治马铃薯黑痣病的生防细菌,通过Biolog微生物鉴定系统、16S rDNA序列以及gyrA、gyrB、rpoB和rpoC多基因序列分析对生防细菌进行分类鉴定。通过盆栽试验比较生防细菌菌株发酵液、无菌体上清液和菌体悬浮液对马铃薯黑痣病的防治效果,利用高效液相色谱（HPLC）对脂肽提取物进行分离,通过抑菌活性测定结合质谱（UPLC-Triple TOF-MS/MS）技术鉴定生防细菌产生的抑菌活性物质。采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术测定马铃薯根际黑痣病菌的DNA拷贝数。【结果】通过对2 106株细菌进行筛选,获得3株有效防治马铃薯黑痣病的生防细菌,其中HMB33604菌株对马铃薯黑痣病的防治效果较高,达到52.9%。通过生理生化及多基因序列比对,将HMB33604菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。该菌株发酵液和上清液对马铃薯黑痣病具有显著的防治效果,分别为52.2%和66.4%,而菌体悬浮液对马铃薯黑痣病的防治效果仅为16.9%,证明该菌株主要通过产生抑菌活性物质而起到防治马铃薯黑痣病的作用。HMB33604菌株可以产生泛革素（fengycin）、伊枯草菌素A（iturin A）和表面活性素（surfactin）,抑菌试验证明泛革素和伊枯草菌素是HMB33604菌株产生的主要抑菌活性物质,这两种脂肽类抗生素能够显著抑制黑痣病菌的生长,并且造成菌丝畸形。菌株发酵液和无菌体上清液均显著降低马铃薯根际黑痣病菌的DNA拷贝数,与对照相比分别降低了60.3%和64.0%;而菌体悬浮液处理后根际黑痣病菌的DNA拷贝数仅降低10.3%。【结论】获得一株有效防治马铃薯黑痣病的生防细菌——解淀粉芽孢杆菌HMB33604,该菌株主要通过产生抑菌活性物质而发挥生防作用。泛革素和伊枯草菌素是HMB33604菌株产生的主要抑菌活性物质。泛革素和伊枯草菌素不仅造成黑痣病菌菌丝畸形,还可显著降低马铃薯根际黑痣病菌的数量,从而有效防治马铃薯黑痣病。     

盐胁迫下枯草芽孢杆菌NCD-2对番茄促生作用及对土壤微生物群落结构的影响

【目的】探讨盐胁迫下生防枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2菌株对番茄的促生效果及对土壤微生物群落多样性的影响,为拓宽NCD-2菌株的应用提供理论依据。【方法】采用温室盆栽试验,测定盐胁迫下NCD-2菌株对番茄株高、地上部、根部干重和鲜重的影响,并测定抗逆相关酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性和脱落酸（ABA）含量;采用高通量测序（Illumina MiSeq）技术测定NCD-2菌株菌悬液处理（NCD0）、100 mmol·L^-1 NaCl处理（CK100）、NCD-2菌株菌悬液+100 mmol·L^-1 NaCl处理（NCD100）和清水处理作为对照（CK0）条件下土壤真菌、细菌群落结构,分析盐胁迫下NCD-2菌株对番茄根际土壤微生物群落结构的影响。 【结果】正常条件下,经NCD-2菌株处理,番茄株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重分别较对照增加了9.08%、10.37%、16.64%、15.42%和16.78%;在100 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下,经NCD-2菌株处理,番茄株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重分别较对照增加了16.86%、18.96%、21.32%、10.50%和23.99%。盐胁迫下,经NCD-2菌株处理,番茄体内SOD、POD、CAT活性和ABA含量分别较对照提高了50.45%、56.18%、29.55%和34.60%。细菌群落组成分析表明,在没有盐胁迫的条件下,NCD-2菌株处理后番茄根际放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）菌群的相对丰度分别较清水对照（CK0）提高了7.28%、15.14%和23.03%;节杆菌属（Arthrobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、微枝形杆菌属（Microvirga）和链霉菌属（Streptomyces）菌群的相对丰度分别较CK0提高了50.88%、15.31%、11.32%和16.41%。在100 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下,经NCD-2菌株处理,番茄根际变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门、厚壁菌门（Firmicutes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）菌群的相对丰度分别较单独NaCl处理（CK100）提高了6.08%、8.19%、14.11%和4.70%;节杆菌属、芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘氨醇单胞菌属和微枝形杆菌属菌群的相对丰度分别较CK100提高了5.54%、31.80%、23.39%和23.08%。真菌群落组成分析表明,在没有盐胁迫的条件下,NCD-2菌株处理后番茄根际被孢菌门（Mortierellomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）和壶菌门（Chytridiomycota）菌群相对丰度分别提高至CK0的186%、477%和1 650%;小被孢霉属（Mortierella）、木霉属（Trichoderma）和光黑壳属（Preussia）菌群分别提高至CK0的186%、108%和120%。在100 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下,NCD-2菌株处理后番茄根际被孢菌门、球囊菌门和壶菌门菌群分别提高至CK100的345%、154%和921%;小被孢霉属较CK100提高了246%。 【结论】盐胁迫环境下NCD-2菌株处理后通过提高番茄体内抗逆相关酶的活性、ABA的含量,增加番茄根际有益微生物的种群数量,从而提高了番茄对盐胁迫的耐受能力,显著促进了番茄的生长发育。     

利用微生物杀菌剂防治马铃薯黄萎病

马铃薯黄萎病是一种重要的世界性土传兼种传维管束病害，危害大且防治困难。利用活体微生物杀菌剂是防治作物土传病害的有效措施之一。本研究通过盆栽试验评价了微生物杀菌剂枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对马铃薯出苗和生长的安全性，在河北省马铃薯主产区开展田间小区试验，研究了该制剂有效防治马铃薯黄萎病的使用方法和适宜施用剂量，并在河北省涞源县、围场县和永年区3县区分别开展了田间示范应用。盆栽试验和田间试验结果表明，枯草芽胞杆菌可湿性粉剂15、30和45 kg/hm²拌种处理对马铃薯出苗安全，对马铃薯生长没有不良影响；田间小区试验表明，在围场县试验田中，该制剂30 kg/hm²拌种处理单独使用或30 kg/hm²拌种加15 kg/hm²初花期滴灌使用均能显著减轻马铃薯黄萎病的发生，分别增产15.53%和17.10%；在新乐市试验田，枯草芽胞杆菌可湿性粉剂30 kg/hm²拌种处理显著增加马铃薯产量16.38%。田间示范应用结果表明，枯草芽胞杆菌可湿性粉剂30 kg/hm²拌种处理在涞源县和围场县防治马铃薯黄萎病效果显著，防效分别为84.22%和72.93%，两地分别显著增产24.30%和9.27%；在邯郸市永年区，相比化学药剂对照处理，枯草芽胞杆菌可湿性粉剂30 kg/hm²拌种处理显著增加马铃薯产量19.73%。本研究表明，枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄萎病具有显著的防治效果和显著的增产效果，为该制剂在马铃薯生产中高效应用提供了科学依据。     

防治马铃薯黄萎病芽胞杆菌种子处理剂的研制及应用

芽胞杆菌属菌株已被广泛应用于植物土传病害的生物防治。本研究以枯草芽胞杆菌NCD-2和解淀粉芽胞杆菌Ba-2为有效成分开展了防治马铃薯黄萎病的种子处理剂研制。通过对载体、助剂种类及其比例的优化，明确种子处理剂的配方为：载体滑石粉75%、菌株NCD-2原粉13.33%、菌株Ba-2原粉6.67%、分散剂B 3.50%、润湿剂B 1.50%；制备的种子处理剂外观为浅黄色粉末，无团块。该菌剂粒径D50为36.78 μm，pH 6.85，贮藏后未出现结块和发粘现象，浓度介于1.5×10⁹～2.0×10⁹ CFU/g。作物安全性试验表明，种子处理剂用量在1～4 kg/667 m²拌种马铃薯种薯，校正出苗率与空白对照差异不显著；进一步研究以4 kg/667 m²拌种薯块不同时间对出苗的影响，明确拌种后不宜长时间放置，以2 d内播种为宜。两年多地田间试验表明，种子处理剂对马铃薯黄萎病的防治效果为48.58%～72.82%，增产为5.52%～14.32%。综合分析表明，该菌剂能够有效防治马铃薯黄萎病发生，且增产作用明显，具有广阔的应用前景。研究结果为该菌剂进一步的大面积推广示范应用奠定了基础。     

L-脯氨酸对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成的影响

 枯草芽胞杆菌 NCD-2菌株在棉花品种‘冀棉11'根际的定殖能力与其根系分泌物中的L-脯氨酸相关。本研究通过外源添加L-脯氨酸评价其对NCD-2菌株生长量和生物膜形成的影响。结果表明,在MSgg培养基中添加L-脯氨酸培养48 h后对菌株生长不存在显著影响。采用称重法测定生物膜的湿重和干重,结果表明在MSgg培养基添加L-脯氨酸显著增加了生物膜产量,且生物膜的褶皱程度和立体结构变得更为明显。采用结晶紫染色法进行生物膜的定量测定发现,浓度为1.250～10.000 mg·mL^-1的L-脯氨酸可以显著提高菌株生物膜形成能力,而低浓度0.625 mg·mL^-1 的L-脯氨酸对生物膜形成无影响。通过RT-qPCR检测了NCD-2菌株生物膜形成相关基因tasA和epsA表达量的变化,结果表明,添加上述不同浓度L-脯氨酸能够显著提高tasA基因表达量,提高了2.53~9.98倍。除了浓度为0.625 mg·mL^-1 L-脯氨酸可提高epsA基因表达外,其他浓度没有显著改变epsA基因的表达,而且epsA基因表达量低于tasA基因。综合分析表明,L-脯氨酸促进NCD-2菌株生物膜形成不是通过改变菌株生长量,而是诱导tasA基因的表达产生更多的胞外蛋白TasA。     

花铃期棉花黄萎病抗病与感病品种对 土壤细菌群落结构的影响

【目的】研究花铃期棉花黄萎病抗/感品种土壤细菌群落结构,了解抗/感品种土壤细菌群落结构与土壤理化性质之间的关系,为棉花黄萎病的监测与绿色生态防控打下理论基础。【方法】通过田间小区试验,以感病品种（鄂荆1号,EJ）和抗病品种（冀863,J863）为试验材料,采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）和高通量测序（Illumina MiSeq）技术分别测定花铃期不同阶段（盛花期、开花后期和结铃期）土壤中大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）数量和土壤细菌群落结构,结合冗余分析（RDA）明确细菌群落结构与土壤理化性质的相关性。【结果】棉花黄萎病的发生与土壤中大丽轮枝菌ITS基因拷贝数量存在不同程度的相关性,其中感病品种EJ的发病率和病情指数与土壤中病原菌数量呈正相关,而抗病品种J863的发病率和病情指数与病原菌数量相关性不大。除盛花期外,棉花开花后期和结铃期抗病品种J863土壤中的病原菌数量低于感病品种EJ。高通量测序分析表明,除开花后期,抗病品种J863在盛花期和结铃期的细菌丰富度Chao1和ACE指数均高于感病品种EJ。主成分分析表明,抗/感品种之间及其在花铃期不同阶段的土壤细菌群落结构存在差异。群落组成方面,在门水平上,感病品种EJ的部分优势菌群平均相对丰度低于抗病品种J863,如放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硝化螺菌门（Nitrospirae）、Patescibacteria和装甲菌门（Armatimonadetes）,降低幅度分别为16.38%、4.05%、2.25%、6.58%、7.10%、20.60%和35.78%;在属水平上,感病品种EJ的部分优势菌群平均相对丰度低于抗病品种J863,包括鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌属（Blastococcus）、红色杆菌属（Rubrobacter）、类诺卡氏属（Nocardioides）、Pontibacter、链霉菌属（Streptomyces）、Gemmatirosa、微单孢菌属（Micromonospora）和Solirubrobacter,下降幅度分别为5.09%、19.41%、13.79%、2.36%、10.78%、34.47%、46.76%、61.84%、52.75%、48.61%、74.79%、9.13%和26.42%。冗余分析（RDA）表明,土壤细菌群落结构受硝态氮（NO₃ ^--N）、速效磷（AP）、铵态氮（NH₄ ⁺-N）、无机磷（IP）、pH和有机质（OM）指标影响。【结论】土壤中大丽轮枝菌的数量与棉花抗/感品种黄萎病发生的相关性存在差异,感病品种黄萎病的发生程度与土壤中病原菌数量呈正相关。抗病品种在盛花期、开花后期和结铃期土壤的细菌群落结构优于感病品种,并且不同生育时期的优势菌群存在一定程度的差异。土壤中细菌多样性、相对丰度和组成受有机质、pH、氮素类型、速效磷等指标影响。同时,棉花不同生育时期对土壤中细菌群落结构有明显影响。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。     

解淀粉芽胞杆菌PHODB35对小麦的促生作用及产量影响

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens PHODB35是一株具有抑菌和促生作用的多功能菌株。为了明确其对小麦的促生作用，通过离体平皿法研究菌株PHODB35发酵液对小麦种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明，菌株PHODB35发酵液对种子萌发和芽长生长存在不同程度影响，其中高浓度发酵液（10×10⁸和2×10⁸ CFU/mL）对上述指标具有抑制作用，低浓度发酵液（1×10⁸、1×10⁷、2×10⁶和1×10⁶ CFU/mL）对种子萌发不存在显著影响，但促进芽长的生长，其增长幅度为13.48%~20.22%，初步明确了菌株PHODB35适宜的接种浓度为1×10⁸ CFU/mL。温室盆栽试验表明，在该接种浓度处理后小麦的株高、鲜重、干重和基质有效磷含量均有不同程度的增加。同时以该菌株为活性成分研制的有机肥料（浓度为1×10⁸ CFU/g）的盆栽试验结果表明，随着PHODB35有机肥用量的增加，分别提高了基质有效磷和小麦植株全磷含量3.86和3.55倍，其促生作用优于普通有机肥。多地区的田间试验表明，PHODB35有机肥处理（T3）在产量方面高于化学肥料减施处理（T2），增产率5.31%~9.06%。该研究结果为解淀粉芽胞杆菌PHODB35有机肥的进一步产业化开发和应用提供了科学依据。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。