正义、反义、干涉调控肉桂酰辅酶A脱氢酶基因对烟草的影响

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是在木质素合成途径中起到关键作用的酶,负责催化肉桂酰辅酶A类物质的还原反应生成相应的醛类化合物.分离得到毛白杨CCR基因的cDNA.将CCR基因以正义、反义和干涉的形式,通过农杆菌介导的方法转入烟草中,Southem杂交以确定转基因成功.在获得的转基因植株中,所有下调基因的植株都表现出可溶性酚酸含量下降,木质素含量也有明显的下降趋势,纤维素含量则有上升,可能是对木质素含量下降的一种代偿性增长.植物细胞壁组分的含量变化表明CCR基因可能是一个控制木质素代谢途径的一个很好的调控点.     

杨树不同组织中ARF 表达与生长素相关性研究

木质素的生物合成是一个复杂的过程,有许多酶参与了此过程.生长素响应因子(ARFs)在木质素合成过程中起着重要作用,通过调节早起生长素基因的表达,从而影响基因的转录活化或抑制.利用A RFs已有序列及杨树基因芯片数据对其进化及与生长素的相关性进化分析,结果表明,杨树ARF序列的保守性高达60％;生长素含量、上调基因数目与基因表达信号量两两之间在夏秋季节中表现为高度相关,冬季对生长素响应因子信号量的影响最大.     

毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶对烟草木质素的影响

为了研究阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)在木质素合成途径中的调控作用,采用CTAB法提取毛白杨RNA,反转录得到cDNA并克隆出毛白杨F5H基因,将其以正义、反义、干涉的基因形式,使用农杆菌侵染法导入烟草基因组中.将得到的转基因植株茎段进行解剖分析,并测定其木质素细胞壁化学组成.转基因植株的木质素、纤维素总量和木质部解剖分析结果与野生型相比均为未表现出明显差异,植株正常生长.F5H的过量表达和基因沉默均不影响植株木质化和生长,可以说明它是木质素合成途径可供选择的一个很好的调控点.     

对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80 ℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。      

用毛细管电泳-质谱(CE-MS)内标法检测杜仲中绿原酸

杜仲作为一种传统的中药材,其药用成分主要为次级代谢产物绿原酸,是很多种中草药的重要活性成分,广泛存在于杜仲叶片和忍冬科植物的干燥花蕾或初开的花朵中。本研究提供了一种高效准确的从植物样本中检测绿原酸的方法。该方法使用萘乙酸作为内标物提高定量的精确性,减少系统误差,并通过毛细管电泳联用质谱定性提高检测的灵敏度。毛细管电泳联用质谱仪建立萘乙酸标准品与绿原酸标准品的标准曲线,其中萘乙酸与绿原酸的标准曲线相关性系数分别为0.999 4和0.999 1,均大于0.999 0,说明仪器方法及毛细管电泳参数与质谱参数可靠。绿原酸标准品分别以杜仲与金银花植物粉末作为基质,其添加回收率分别为93.61%和97.43%,说明提取方法的提取效率较高。为验证方法的适用性,运用本方法检测分析得出杜仲植物粉末中绿原酸含量为0.92%,金银花植物粉末中绿原酸含量为1.31%。      

毛白杨细胞色素C还原酶的基因克隆、表达和亚细胞定位

为克隆得到毛白杨CPR基因、成功在体外表达可溶性蛋白并通过构建GFP偶联载体观察其亚细胞定位,本研究通过RT-PCR的方法克隆得到了毛白杨CPR基因,登录号为MK575137。进一步通过生物信息学分析,发现毛白杨CPR与毛果杨CPR同源性最高,均有着典型的细胞色素C还原酶结构域。随后在酵母表达体系中表达该蛋白,验证了该蛋白不能被分泌表达,表明CPR蛋白为膜蛋白。进一步的亚细胞定位实验表明,CPR蛋白定位于内质网。CPR蛋白是P450单加氧化酶催化木质素合成的相关过程中必不可少的辅酶,该研究可为今后体外验证毛白杨P450单加氧化酶在木质素合成的相关过程中的酶活活性提供基础。     

重组酶Cre基因在大肠杆菌中的高效表达及其一步纯化和活性检测

为了实现DNA重组酶Cre在体外的应用, 以pET-30a高效表达载体为基础构建了pTE30-Cre质粒.将此质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导的Cre基因的高效表达.对表达出的Cre重组酶蛋白进行镍离子鳌合法一步纯化,并以带有两个同向loxP位点的质粒为底物,对纯化出的Cre酶进行活性检测.该实验为Cre酶的体外应用奠定了基础.      

5种杨树苗期形态及生理结构特征比较初探

本研究以毛果杨、毛白杨、银灰杨、欧美杨和胡杨为研究对象,对其苗期生长、光合作用、微观结构、木质素组成、激素含量等多个指标进行分析比较,旨在寻找其苗期生长和生理特征上的差异,探究不同杨树生长速度不同、应用不同的原因,进而指导应用。研究发现毛白杨、银灰杨和欧美杨表现出栽后缓苗迅速、生长速度快的特点。可能是受到较强光合作用(有机物合成积累)和较强蒸腾作用(水和无机盐的运输)双重因素的影响,即光合速率高、光合能力强,能合成积累更多有机物;气孔导度值较高、蒸腾速率高,能够有效吸收CO2进行光合,并且能高效运输水和无机盐,在生产应用中具有很大潜力。毛白杨的木质素含量高,适于建筑用材;银灰杨和欧美杨的木质素含量低,适于造纸。同地区栽培的毛果杨和胡杨生长速度慢、生长状况欠佳,在生产上不宜采用。生长速度缓慢除了受光合、蒸腾影响外,也可能与激素含量有关,赤霉素含量较高会导致木质部细胞早期分化程度高。毛果杨虽生长缓慢,在我国引种相对较少,但是作为林木树种遗传转化研究中的代表种,意义重大。而胡杨能够抵御干旱盐碱,具有防护作用,这可能与其cis-ABA含量较高、气孔导度低、蒸腾速率低、水分丧失少有关。      

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的底物制备及酶学特性研究

采用原核表达体系和HPLC法,分别获得肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)及其反应底物———香豆酰CoA酯,并对CCR酶学特性进行研究分析。结果表明,通过酶学方法和HPLC的分离纯化能够得到较高浓度和纯度的CCR反应底物;重组毛白杨CCR的最适反应温度是37℃,最适pH值为6.25,Km值为5.664μmol/L,Vmax为4.09 nmol/Ls。