VIGS实验技术体系在月季中的应用及优化

旨在月季中建立高效、快速的VIGS实验技术体系,以期能够改进VIGS技术体系在月季等木本植物表达效率低等缺陷。采用RT-PCR方法进行月季RhPDS 基因片段的克隆,在以pTRV2 为原载体,采用双酶切的方法构建了pTRV2-RhPDS 重组载体。经双酶切及测序验证后,通过电击法转化农杆菌GV3101,并分别采用高压喷枪法对月季植株进行侵染、采用真空渗透法对扦插苗以及组培苗进行侵染。采用qRT-PCR方法分析RhPDS 基因的表达。结果显示：构建的重组载体pTRV2-RhPDS,经双酶切验证,显示条带单一清晰,符合预期目标。在侵染方法和材料上,采用真空渗透法侵染组培苗是最为快速、高效的方式。该试验获得了较为高效、快速VIGS 技术体系,提高了VIGS 技术体系在月季上表达效率。     

基于再生不定芽的蝴蝶兰继代扩繁体系建立

为降低蝴蝶兰通过再生原球茎途径频繁继代培养可能出现的变异及玻璃化风险、减轻继代培养中的褐化,以蝴蝶兰花梗茎段再生的营养芽为试验材料,进行基于再生不定芽的继代扩繁及抗褐化研究。结果显示,以5节花梗的中间腋芽茎段为材料,在VW+ 6-BA 5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L培养基上进行启动培养,能获得最高的营养芽诱导率。继代培养中,TDZ促进再生不定芽的效果比6-BA强。茎芽经过“切叶”处理,在培养基VW+ TDZ 1 mg/L+300 mg/L柠檬酸+10 g/L蔗糖+15%椰汁,或培养基VW+ 6-BA 5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ 300 mg/L柠檬酸+10 g/L蔗糖+15%椰汁上进行继代培养,能获得最佳的继代扩繁效果。笔者研究认为初步建立了基于再生不定芽的蝴蝶兰继代扩繁体系。     

百合雌蕊中杂交亲和性与不亲和性差异表达基因分析

东方百合与卷瓣组野生百合杂交(简称OS组合)，属于亲缘关系最远的组间杂交，杂交障碍最大。挖掘雌蕊中杂交亲和性与不亲和性差异表达基因，有可能解释不亲和性杂交中引起花粉管定向生长异常的机理，进而阐明不亲和性杂交的分子机理，为实施克服杂交不亲和障碍技术措施提供依据。本研究采用抑制消减杂交技术(SSH技术)，分别以不亲和性杂交和亲和性杂交的东方百合雌蕊为试验组(tester)和驱动组(driver)，建立正向抑制消减杂交文库，随机挑选180个阳性克隆，经过测序、去劣、去冗余、序列比对，有113个EST与数据库中的已知序列具有同源性，最终获得10个差异表达基因。采用RT-PCR技术对10个差异表达基因进行验证，其中有1个基因在不亲和性杂交的雌蕊中表达上调、7个基因表达下调、2个基因无明显变化。对差异表达基因进行功能注释及分类，差异表达基因主要集中于信号转导(包括丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2A-3、钙依赖蛋白激酶CDPK、小G结合蛋白)、抗逆防御(包括分子伴侣(clpB)、过氧化氢酶CAT2)、转运(包括质膜ATPase、焦磷酸酶质子泵)、蛋白命运(包括60S核糖体蛋白)等功能类别。据此推测，在东方百合×山丹组(系)间不亲合性杂交育种过程中，可能引起雌蕊与花粉管信号交流异常、物质转运能力减弱和雌蕊耐受逆境能力降低，从而导致杂交不亲和性。      

黄菖蒲-枯草芽孢杆菌净化体系根际细菌多样性分析

[目的]探究黄菖蒲-枯草芽孢杆菌净化体系在河道底泥净化方面的作用,为水生植物-细菌联合修复河道提供技术支持.[方法]利用16SrDNA测序技术分析黄菖蒲-枯草芽孢杆菌净化体系根部细菌的多样性、丰富度和群落结构的变化,细菌组间差异物种和细菌群落的功能.[结果]黄菖蒲-枯草芽孢杆菌净化体系没有显著改变细菌聚类和物种分类数量、群落丰富度,但是有效改变底泥细菌群落多样性状况,使根部底泥中富集细菌的功能主要集中在还原硝酸盐、氧化铵硫化物、吸收氮元素和代谢硝酸盐.[结论]黄菖蒲-枯草芽孢杆菌净化体系能够有效改变河道底泥中的细菌多样性,增强净化水体的功能.     

菠萝百合组织培养技术研究

以菠萝百合花序上胚珠为外植体,接种于3种诱导培养基中,发现加有少量激素的MS+NAA 0.01mg/L及MS+6-BA 0.01mg/L培养基上的胚珠萌芽率明显高于未加激素的MS培养基。以启动培养获得的叶片及小鳞茎纵切块为外植体,接种到3种继代培养基中,发现两种外植体在3种继代培养基上均能分化出不定芽,MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L(S3)为最适初次继代培养基。以S3培养基为基础,设计了6种配方进行第二次继代培养研究,发现MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L(T4培养基)上发育的不定芽数最多、质量最好,可作为最适继代培养基。离体生根研究发现:培养基中添加NAA比IBA生根质量更好,最适生根培养基为MS+NAA 0.1mg/L。至此,建立了菠萝百合组培快繁技术体系。     

火鹤八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与其表达分析

旨在为火鹤叶色和花色呈色机理研究提供一定理论依据。以火鹤‘阿拉巴马’为材料,提取火鹤肉穗花序中的总RNA,采用RACE技术克隆得到了八氢番茄红素脱氢酶基因(Aa PDS),通过RT-PCR分析其表达变化。八氢番茄红素脱氢酶基因(Aa PDS)c DNA全长为2226 bp,其中开放阅读框(ORF)共1767个碱基,编码588个氨基酸。序列比对后发现火鹤Aa PDS序列与鹤望兰、水仙、烟草、葡萄、黑藻、向日葵等PDS氨基酸序列存在高度同源性,有74%~79%的一致性。系统进化分析表明火鹤Aa PDS与黑藻、水稻、水仙、鹤望兰等单子叶植物的PDS基因聚类在一起应用。RT-PCR分析表明,Aa PDS在肉穗花序中表达量最高,在佛焰苞中表达次之,在叶、茎、根表达量依次降低。以上结果可见,通过分子生物学进行系统分类与传统植物表观分类学结果一致。类胡萝素代谢途径中的PDS基因在火鹤花器官成色中起一定作用。     

百合类胡萝卜素代谢途径关键酶基因的分析及LoLcyB的克隆

本研究以东方百合品种‘Justina’叶片的5个生长阶段(10 d,25 d,50 d,75 d和100 d)和生长100 d的花柱、花药、花瓣、叶片、茎、鳞茎和根这7个不同部位为试验材料,采用有机溶剂法测量百合类胡萝卜素和叶绿素含量,根据转录组文库测序结果对百合类胡萝卜素代谢途径的12个关键酶基因(PSY,PDS,Z-ISO,ZDS,CRTISO,LCYB,LCYE,%HYB,VDE,ZEP,CCS和NCED)进行半定量表达分析,并克隆百合LCYB基因的ORF序列,并对其进行相关的生物信息学分析。结果显示,在百合叶片生长的5个不同阶段和百合成熟期的7个不同部位中,类胡萝卜素和叶绿素含量出现显著差异的现象,在不同生长阶段和不同部位12个关键酶基因的表达量各不相同。LCYB基因的完整开放阅读框(ORF)被克隆得到,全长1 503 bp,编码500个氨基酸,具有典型的Carotene Cycl超级家族保守区域特征,在已知全基因组植物中与小果野蕉(Musa acuminata)亲缘关系最近。本研究为百合类胡萝卜素代谢途径的进一步研究,深入了解百合花色和叶色合成的分子机理提供了坚实的理论基础。     

百合LoNHX2基因的克隆与表达分析

[目的]为了解决百合在北方盐碱地区百合种球生长和产量的问题.[方法]以OT型百合'Robina'为材料,克隆了百合液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因(LoNHX2),并使用前期试验得出的半致死浓度200 mM NaCl对百合种球进行处理,通过荧光定量分析百合LoNHX2基因在盐处理后不同时间及不同部位的表达状况.[结果]结果表明:(1)百合LoNHX2基因全长为1 608 bp,编码525个氨基酸;(2)百合LoNHX2蛋白性质稳定,由20种氨基酸组成,为脂溶性蛋白;(3) 200 mM NaCl对百合种球根系进行盐胁迫处理后,LoNHX2基因在百合根部的表达量随时间变化,呈先上升再下降趋势;(4)对百合盛花期不同部位中LoNHX2基因表达量分析,LoNHX2基因在花瓣中表达量最高,其次是叶片、茎、根,表达量最低的是鳞茎.[结论]发现百合LoNHX2基因在盐胁迫中有重要作用,可通过降低细胞质中Na+的浓度,从而降低高盐胁迫对植物细胞的伤害.为百合种球耐盐分子育种提供理论依据,对百合在北方产业化发展及园林应用方面具有重要意义.     

基于ITS条形码技术分析北京云蒙山杜鹃花属遗传多样性

为从分子生物学角度综合评价国内外杜鹃花属物种系统发育关系,采用北京云蒙山地区4个迎红杜鹃亚属的迎红杜鹃和1个杜鹃亚属的照白杜鹃为供试材料进行ITS序列测定,并与从Genbank数据库中得到杜鹃花属17种不同种源的ITS序列,对22种杜鹃花亚属供试材料ITS序列在选用K2模型,采用邻接法(neighbor-joining method)和最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树,分析杜鹃花亚属中各种源的系统位置,将供试杜鹃花亚属分为2大类5小类。22种供试材料均按照所属亚属被分到了不同分支,分类结果与传统的形态学分类结果较为一致。通过ITS序列比对发现,杜鹃花属的22份供试材料序列的一致性为95.29%,说明杜鹃花属ITS序列具有较高的保守性。同时,杜鹃花属的22份供试材料ITS序列均有不同程度的变异,共有80个有效变异位点,这些变异位点可以作为杜鹃花属种源的DNA指纹特异识别位点。为探讨北京云蒙山杜鹃花属种源的分类地位提供分子证据,对系统分析云蒙山杜鹃花属野生杜鹃群落的遗传多样性以及特异种质的保护、利用和开发具有重要意义。