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11.
牛Nanog基因克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究克隆了牛Nanog基因,构建其真核表达载体,并转染皮肤成纤维细胞,获得能够用作核移植供核细胞的稳定转染细胞株。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT—PCR扩增Nanog基因,将其克隆到pMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pCDNA3-FLAG表达载体上,挑选序列正确的真核表达质粒pCDNA3-Nanog转染牛皮肤成纤维细胞,获得了稳定转染的细胞株。用RT—PCR和Western Blotting分别检测NanogmRNA和FLAG-Nanog融合蛋白的表达,用免疫染色法验证该细胞株是否具有干细胞特征。结果表明：（1）从胎牛原始生殖嵴中克隆了序列正确的Nanog全长编码序列;（2）所构建的pFLAG-NanDg重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中高效表达;（3）所获稳定转染的细胞株能表达Es细胞表面抗原SSEA-4和多能性维持因子Nanog、Oce-4,表明其具有一定的多能性。为进一步研究Nanog基因功能,尤其是探讨它在家畜早期胚胎发育、生产转基因动物,以及胚胎干细胞建系中的作用奠定了基础。 相似文献
12.
牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。 相似文献