转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅱ.Bt杀虫晶体蛋白抗体的制备

用碳酸钠裂解液(50mmol/LNa2CO3,50mmol/LEDTA,pH10)从BacillusthuringiensisHD-1的孢晶混合物中分离提取杀虫蛋白的基础上,进一步用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳技术纯化杀虫蛋白,获得了高纯度的杀虫蛋白作为抗原,用于免疫家兔制备抗体。比较了不同抗原注射剂量的免疫效应和免疫过程中(不同注射时间)抗体生成量的变化。结果表明,供试的二种抗原注射剂量对抗体的效价无明显影响,随着免疫次数的增加抗体效价不断上升,最终获得了用琼脂双扩散测定效价为1/120的抗血清。Bt杀虫蛋白的免疫原性低。抗血清中的抗体免疫球蛋白(Ig),首先经硫酸铵分级沉淀粗提,再用DEAE-52纤维素柱层析提取纯化,获得了高纯度的IgG,为抗体的酶标记和ELISA检测杀虫蛋白等研究提供了高特异性的Bt抗体。研究的结果为Bt菌HD-1杀虫蛋白抗体的制备提供了依据。     

四川药用植物病害调查与病原鉴定 Ⅰ．主要栽培药用植物病害

对四川省24种主要栽培药用植物病害种类进行田间系统调查，采集病害标本，通过症状观察和病原鉴定，确诊了113种病害，其中25种为国内新记录。明确了每种药用植物的主要病害，为药用植物病害的防治和深入研究提供了重要依据。     

小麦赤霉病的生物防治研究 Ⅲ .拮抗芽孢杆菌B4、B6菌株的防病机制

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B4和B6菌株对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的作用机制主要是通过产生抗生代谢产物抑制病菌的孢子萌发和菌丝生长。抗菌物质无挥发性,主要为脂溶性和水溶物质。通过硫酸铵盐析和SDS-PGE分析,抗菌蛋白是重要的抗菌物质,蛋白组分的分子量范围在20～63kD之间。最适于两菌株产生抗菌物质的条件是:YSP培养基、pH7 0、28℃和充足的氧。产生抗菌活性物质的高峰期,分别是在培养72h(B6菌株)和96h(B4菌株)。抗菌物质在酸性和中性条件下对热稳定,在碱性条件下则不稳定。     

转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅰ.Bt菌HD-1的杀虫晶体蛋白抗原制备

研究了培养时间对苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)HD-1菌株孢晶混合物的产量、杀虫晶体蛋白裂解液的种类和处理温度与时间对杀虫晶体蛋白提取率及纯度的影响。结果表明BtHD-1菌株在Bt生长繁殖平板培养基上,30℃下培养41～55h均可获得大量孢晶混合物。采用50mmol/LNa2CO3裂解液处理孢晶混合物,可获得纯度高的130kD杀虫晶体蛋白,而用40mmol/LNaOH提取的杀虫晶体蛋白中含有较多杂蛋白。所研究的处理温度和时间对杀虫晶体蛋白提取量和组成无明显影响。这些结果为杀虫晶体蛋白抗原的制备提供了依据。     

转Bt抗虫基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅲ.酶联免疫(ELISA)间接法检测Bt杀虫蛋白研究

采用ELISA间接检测法,研究了2种酶标羊抗兔抗体(辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶)和2种检测载体(聚苯乙烯多孔板和硝酸纤维膜)对检测灵敏度和样本检测效果的影响。结果表明,在采用纯的杀虫晶体蛋白进行灵敏度检测时,2种酶标抗体的测定结果非常相近,无明显差别,灵敏度可达7·8~15·6ng。但在检测植物样本时,不同酶标抗体则存在差异。表现为碱性磷酸酶标记的抗体优于辣根过氧化物酶标记的抗体。这主要是由于植物样本中有内源过氧化物酶所致。用硝酸纤维素膜和聚苯乙烯多孔板作载体进行检测纯的Bt杀虫蛋白的效果二者相当。但检测植物样本时,植物中的叶绿素对Dot-ELISA的干扰很大,准确性差。本研究所制备的Bt杀虫蛋白抗体具有高的特异性。     

蚕豆油壶菌火肿病的组织病理学

 为了解巢豆油壶菌（Olpidium viciae）侵染蚕豆叶片和茎引起细胞和组织的病理学变化,采用光学显微镜观察蚕豆叶和茎的病、健表皮组织及组织切片的解剖结构和病原物在寄主细胞中的动态。结果表明,巢豆油壶菌侵入叶和茎的表皮细胞后,定殖在被侵入的细胞内,菌体生长发育,整体产果,形成游动孢子囊和休眠孢子囊。病菌的侵染刺激了侵染点邻近的表皮细胞和其下的叶肉组织或茎的皮层组织细胞,这些已分化的组织细胞转为分生细胞,进行分裂,分裂方式为平周分裂。原有的正常基本组织细胞被未高度分化的薄壁组织细胞取代。这些细胞具有分生能力并不断分裂,细胞体积增大,造成蚕豆病组织细胞发生畸形增生的病理解剖改变,病部呈瘤状隆起。这是蚕豆油壶菌火肿病症状产生的病理组织学机制,也反映了巢豆油壶菌和蚕豆在细胞和组织水平上的相互作用。     

四川省不同来源核盘菌菌株的可溶性蛋白和酯酶同工酶的电泳图谱分析

选取四川省不同地区、不同寄主、代表不同致病性水平和不同菌丝体亲和性表现的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌株进行可溶性蛋白和酯酶同工酶电泳分析,结果表明:不同寄主来源、不同致病性水平、不同菌丝体亲和性表现的核盘菌菌株间的可溶性蛋白和酯酶同工酶电泳图谱条带数量及分布相对稳定,仅部份弱带在出现频率、染色强度或迁移距离上有一定的变化,表现出种的特征和种内的异质性,在分类上具有一定的意义,可溶性蛋白和酯酶同工酶电泳分析可作为核盘菌分类和遗传多样性分析的一个生化指标。     

四川省鹅掌柴炭疽病病原菌的初步鉴定

炭疽病是鹅掌柴发生最严重的病害之一。本文从四川省成都市采集疑似为炭疽病的鹅掌柴病叶,进行了分离培养,获得培养形态完全不同的2株炭疽菌,致病性测定发现它们都为致病菌。多基因(核糖体内转录间隔区、肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、几丁质合成酶、β-微管蛋白、钙调蛋白)的系统发育分析发现,分离获得的2株炭疽菌分别与暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)和喀斯特炭疽菌(C.karstii)聚在一起,形成一个明显的分支,结合形态学特点,确定引起成都市鹅掌柴炭疽病的病原菌为暹罗炭疽菌和喀斯特炭疽菌,这是关于这两种病原引起鹅掌柴炭疽病的首次报道。本文还研究了不同的回接方式对致病性测定的影响,砂纸擦拭后选取中老叶片用孢子悬浮液接种是对鹅掌柴炭疽病最好的致病性测定方法。     

黄柏鞘锈菌重寄生菌研究初报

首次报导了重寄生菌寄生黄柏鞘锈菌(Coleosporium phellodendri Kom)的重寄生现象。重寄生菌寄生在黄柏鞘锈菌的夏孢子堆上,在不同的程度上阻碍了鞘锈菌夏孢子堆的发育和夏孢子的释放,寄生严重时甚至不能形成夏孢子。调查表明,黄柏鞘锈菌重寄生菌在7月底8月初开始发生,9月中下旬达到高峰,该重寄生菌在雅安周边县(区)的黄柏鞘锈菌上自然寄生很普遍,在一些黄柏林地,自然重寄生率高达100%,重寄生指数为60～90。经鉴定,黄柏鞘锈菌的重寄生菌为柱隔孢菌(Ramulariasp.)。     

川麦冬炭疽病菌的潜伏侵染和越冬研究

从2004年12月至翌年3月,定期从田间麦冬采集有炭疽病症状和无炭疽病症的叶片,进行洗涤收集炭疽菌分生孢子,测定其存活力,并分离测定样本中是否有炭疽菌存在。结果表明,田间病叶上的分生孢子具有一定存活力,病叶病斑中的越冬病菌菌丝仍具有生活力;无症状样本中能分离到炭疽病菌。这表明川麦冬炭疽病菌具有潜伏侵染特性,能以田间病株上的分生孢子和病组织中的菌丝越冬,作为初侵染源。