MC1R c.676A>G与山羊皮肤色素沉积的关系及其对黑色素合成的影响

为探讨山羊MC1R基因c.676A>G突变与山羊皮肤色素沉积的关系,及其对黑色素合成和cAMP信号通路下游色素相关基因表达的影响:一方面采用直接测序法检测酉州乌羊及其杂交后代群体(120个个体)MC1R基因c.676A>G的突变情况,用色差仪测量不同基因型个体的腹部皮肤色度值,分析c.676A>G突变与皮肤色素沉积的关系;另一方面,构建野生型(MC1R c.676A)和突变型(MC1R c.676G)真核表达载体,采用脂质体介导法转染到小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16-F10)中进行过表达,利用酶标仪检测各组细胞黑色素含量的差异,并通过实时荧光定量PCR方法检测各组细胞中cAMP信号通路下游色素相关基因(MITF、TYR、TYRP1、DCT)的表达差异性。结果显示:酉州乌羊及其杂交后代群体中,c.676A>G位点均以GG基因型占优势,不同基因型群体的皮肤色度值差异不显著(P>0.05)。MC1R突变组(MC1R c.676G)细胞中的黑色素含量极显著(P<0.05)高于MC1R野生组(MC1R c.676A)。MITF、TYRP1和DCT基因在MC1R突变组中的相对表达量极显著(P<0.01)高于野生组,TYR基因在MC1R突变组细胞中的相对表达量显著(P<0.05)高于野生组。综上,MC1R基因c.676A>G不直接影响山羊皮肤色素沉积,但MC1R c.676G能促进B16-F10细胞中黑色素的合成,也能促进cAMP信号通路下游MITF、TYR、TYRP1和DCT等基因的表达,推测MC1R基因c.676A>G与黑色素合成密切相关。     

西藏绒山羊羊绒细度候选基因筛选及其chi-miR-105a靶基因的验证

为研究西藏绒山羊羊绒细度，以及了解相关候选基因对绒山羊产绒性能的影响，本研究对筛选chi-miR-105a靶基因进行验证，以西藏绒山羊为研究对象，联合RNA测序数据和蛋白质组学数据，筛选与羊绒细度相关的关键候选基因，并通过实时荧光定量和双荧光素酶报告基因试验对候选基因进行调控作用验证。结果表明:1)通过转录组和蛋白组数据整理得到384个DE mRNAs，12个DE miRNAs和29个DEPs。通过多组学联合分析发现CXCL10、SRC、CXCL9、FOS、ETV6、GMPS和PIP5K1B基因与羊毛细度相关。2)通过DEG-DE miRNA互作网络图发现chi-miR-105a与靶基因ETV6和PIP5K1B均在网络当中出现。因此对该调控因子进行验证和分析，根据靶基因表达水平试验发现转染chi-miR-105a mimics后引起毛乳头细胞中ETV6基因的mRNA表达显著降低(P<0.001)，而PIP5K1B基因的表达量均无显著变化。3)通过双荧光素酶报告基因试验表明，过表达chi-miR-105a后，ETV6酶活性显著降低，即chi-miR-105a可与ETV6的3′UTR区结合。综上，通过多组学联合分析筛选出与羊毛细度相关基因CXCL10、SRC、CXCL9、FOS、ETV6、GMPS和PIP5K1B。通过双荧光素酶报告基因进行chi-miR-105a与其预测靶基因ETV6和PIP5K1B的靶标验证，确定chi-miR-105a是ETV6潜在的调控因子，本研究为加快优质绒山羊新品种(系)的培养提供理论依据。     

F3代波杂山羊VNN1基因多态性及其与产羔数的关联分析

【目的】 研究泛酰巯基乙胺酶-1(panthenoyl mercaptoethamine-1,VNN1)基因多态性与F3代波杂山羊产羔数的关系,从而从分子水平指导F3代波杂山羊的育种工作。【方法】 选取107只F3代波杂山羊,采集血样提取DNA,根据VNN1基因(登录号:NC_030816.1)外显子序列设计7对引物,进行PCR扩增及测序,运用DNAStar软件分析测序结果,对可能存在的单核苷酸多态性(SNP)位点外显子全群进行PCR扩增测序,并进行Hardy-Weinberg平衡状态及遗传多样性分析;应用SPSS 16.0统计学软件对VNN1基因不同基因型与F3代波杂山羊产羔数进行关联分析。【结果】 在VNN1基因在第5和7外显子中共发现7个SNPs位点:g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11284 C→A、g.11313 T→C、g.18094 C→T和g.18158 G→C,且每个位点均存在3种不同基因型。χ²检验显示,g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态,g.11284 C→A和g.18158 G→C位点均处于Hardy-Weinberg不平衡状态。多态信息含量均为中度多态((0.25<PIC<0.5)。关联分析发现,g.11010 C→T和g.11313 T→C位点与F3代波杂山羊产羔数显著相关,其中g.11010 C→T位点CC基因型产羔数显著低于CT和TT基因型,g.11313 T→C位点TT基因型产羔数显著低于TC和CC基因型(P<0.05);g.10956 A→G、g.11103 C→T和g.18158 G→C位点对F3代波杂山羊产羔数均无显著影响(P>0.05)。【结论】 VNN1基因在第5和7外显子中共发现7个SNPs位点,其中g.11010 C→T和g.11313 T→C位点对F3代波杂山羊产羔数有显著影响,VNN1基因可作为F3代波杂山羊的候选基因。     

关中奶山羊FGF2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】对关中奶山羊成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）基因进行克隆及生物信息学分析，并检测其在山羊各组织中的表达差异，为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】以关中奶山羊乳腺cDNA为模板，采用RT-PCR技术扩增并克隆关中奶山羊FGF2基因完整CDS区序列，进行相似性比对、系统发育树构建及生物信息学分析；运用实时荧光定量PCR方法检测FGF2基因在关中奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢组织中的表达情况。【结果】关中奶山羊FGF2基因编码区长468 bp，可编码155个氨基酸，分子质量为17.26 ku，理论等电点为9.58，其中含量最高的是甘氨酸，占10.3%。相似性比对结果表明，关中奶山羊FGF2氨基酸序列与人、牛、马、兔、绵羊、虎鲸和野猪的相似性分别为98.7%、99.4%、100.0%、98.7%、99.4%、99.4%和62.6%。系统进化树显示，FGF2基因在不同物种间具有高度保守性，与马的亲缘关系最近。关中奶山羊FGF2蛋白不稳定指数为38.39，属于稳定亲水性蛋白质，不含跨膜结构和信号肽；FGF2蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲，分别占比10.32%、14.19%、30.97%、44.52%。蛋白质互作预测分析显示，FGF2蛋白与FGFR、KDR、FGF1、FGFR4、MET和FGFR1等与乳腺生长发育相关的蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR检测到关中奶山羊FGF2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢中均有表达，在乳腺中表达水平最高，其次为卵巢，在背最长肌中的表达水平最低。【结论】关中奶山羊FGF2基因CDS区序列长468 bp，编码155个氨基酸，为亲水蛋白，二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。FGF2基因在关中奶山羊泌乳高峰期的不同组织中均有表达。本试验结果为进一步探究FGF2基因在关中奶山羊乳腺发育中的作用及其具体功能提供了参考。