大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

培养温度对LPS诱导的离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响

为研究温度对离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响,从大黄鱼头肾组织中分离巨噬细胞结合贴壁筛选法得到细胞单层后,在不同温度(16、22和28°C)下培养备用。使用25μg/mL的脂多糖(LPS)孵育细胞2 h后,测定不同培养温度下离体细胞活力、呼吸爆发活性、抗氧化酶(SOD和CAT)活性以及相关基因(SOD、CAT、Hsp70和IL-1β)表达的情况。结果显示,体外培养细胞36 h后,16°C和22°C条件下培养的细胞活力显著高于28°C处理组;LPS处理组大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性显著升高,但SOD和CAT酶活性较对照组显著下降。高温(28°C)显著提高了细胞CAT酶的活性和基因表达水平,但SOD酶活性和基因表达变化差异不显著;LPS显著促进了大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β基因的表达,并且随培养温度升高细胞IL-1β基因的表达水平显著降低;但大黄鱼头肾巨噬细胞Nrf2和Hsp70的基因表达量随温度升高而显著增加,且LPS处理组细胞基因表达水平显著高于对照组。研究表明,温度显著影响了离体大黄鱼头肾巨噬细胞的抗氧化能力和LPS所诱导的促炎基因的表达,Nrf2和Hsp70在这一过程中可能发挥重要作用。     

Gln对中华鳖免疫应激后肝脏.脾脏及肠道HSP70表达的影响

本试验通过研究谷氨酰胺/脂多糖（Gln/LPS）对中华鳖肝脏、脾脏和肠道组织热应激蛋白HSP70表达的影响,考察Gln对中华鳖免疫应激的保护作用与其诱导组织HSP70表达的关系。试验选择体重接近的健康中华鳖24只,随机分为4组,分别腹腔注射0.7%Nacl、500 ugLPS/kgBW、100 mgGln/kgBW和500 ugLPS+100 mgGln/kgBW。采用免疫组化法检测中华鳖肝脏、肠道和脾脏中HSP70的表达,放射免疫法测定血浆皮质醇（COR）含量。结果表明：腹腔注射500 μgLPS/kgBW显著增强了中华鳖肝脏和脾脏组织HSP70的表达（P<0.05）,而补充100 mgGln/kg BW抑制了中华鳖肠道、肝脏和脾脏组织HSP70的表达。推测Gln对免疫应激中华鳖的保护作用与其诱导机体组织HSP70的表达无关。     

中华绒螯蟹铁蛋白基因的克隆及表达分析

铁蛋白普遍存在于生物体内,具有铁离子解毒和储存等功能。在构建脂多糖刺激的中华绒螯蟹cDNA文库的基础上,获得了中华绒螯蟹铁蛋白基因EsFer的cDNA序列,其全长为1 118 bp,包含480 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为159氨基酸,其5′ 和3′ 端的非编码区分别为178 bp和461 bp,预测的分子量为18.3 ku,理论等电点为5.81,在15~37 aa处有一个跨膜螺旋。在5′ 非编码区核甘酸序列的135~162的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。通过荧光定量PCR的方法研究了铁蛋白基因在中华绒螯蟹的组织表达分布,以及经脂多糖刺激后在血淋巴、肠和肝胰腺组织中的表达变化,发现EsFer在中华绒螯蟹血淋巴、肌肉、肠、鳃、心脏、性腺、肝胰腺等组织器官中都有表达,在肝胰腺的表达量最高,血淋巴中表达量最低。经脂多糖诱导后EsFer在血淋巴、肠和肝胰腺呈上调表达。     

仿刺参铁蛋白ferritin基因的序列分析及表达

通过构建仿刺参cDNA文库,获得铁蛋白全长cDNA序列。该基因序列全长792 bp,5′非翻译区长133 bp,开放阅读框长522 bp,编码173个氨基酸,3′UTR长137 bp;预测蛋白分子量为20 ku。5′UTR具有一个高度保守的铁离子应答元件。仿刺参ferritin氨基酸序列具备脊椎动物ferritin的亚铁氧化酶活性中心所特有的保守结构。该序列与海参的同源性最高,达84%,与其它无脊椎动物如:海星、鲍、牡蛎、海葵、线虫、小龙虾和果蝇的同源性为74%~34%;与脊椎动物ferritin重链亚基同源性高于轻链亚基。系统进化分析表明,仿刺参的ferritin与大部分无脊椎动物聚为一支。利用半定量RT-PCR检测,ferritin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体、稚参11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均表达。Quantitative real-time PCR结果显示, ferritin mRNA在未受精卵至原肠期表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量显著增高;在幼参的不同组织中,ferritin mRNA在呼吸树中的表达量显著低于其他3种组织;幼参注射LPS后,4种组织中ferritin mRNA表达量与注射前无显著差异。     

Complete Lipooligosaccharide Structure from Pseudoalteromonas nigrifaciens Sq02-Rifr and Study of Its Immunomodulatory Activity

Lipopolysaccharides (LPS) are surface glycoconjugates embedded in the external leaflet of the outer membrane (OM) of the Gram-negative bacteria. They consist of three regions: lipid A, core oligosaccharide (OS), and O-specific polysaccharide or O-antigen. Lipid A is the glycolipid endotoxin domain that anchors the LPS molecule to the OM, and therefore, its chemical structure is crucial in the maintenance of membrane integrity in the Gram-negative bacteria. In this paper, we reported the characterization of the lipid A and OS structures from Pseudoalteromonas nigrifaciens Sq02-Rif^r, which is a psychrotrophic Gram-negative bacterium isolated from the intestine of Seriola quinqueradiata. The immunomodulatory activity of both LPS and lipid A was also examined.     

穿王消炎粉对LPS诱导大鼠急性肺损伤的治疗作用

【目的】 研究穿王消炎粉对脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)的治疗作用。【方法】 将60只SD雄性大鼠随机分入空白组、左氧氟沙星阳性药物对照组、LPS模型组及穿王消炎粉低(1 g/kg体重)、中(2 g/kg体重)、高(4 g/kg体重)剂量组,每组10只。模型组和给药组大鼠经滴鼻法给予LPS(3 mg/kg体重)制备大鼠ALI模型,24 h后,给药组分别灌胃相应浓度的穿王消炎粉,模型组和空白组灌胃相同体积的生理盐水。治疗4 d后处死大鼠,分离血清、固定并冻存肺脏组织。测定各组大鼠肺脏组织湿/干重比;HE染色观察大鼠肺脏组织病理学变化;ELISA法检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6含量;采用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平和蛋白表达量。【结果】 与空白组相比,LPS模型组大鼠出现肺间质壁增厚,肺泡腔内炎性细胞浸润、出血,肺泡结构破坏等肺损伤症状,肺组织的湿/干重比极显著升高(P<0.01),血清中IL-1β、IL-6含量和肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及蛋白表达量均显著增加(P<0.05)。与LPS模型组相比,各给药组大鼠肺间质增宽现象有所改善,肺组织的湿/干重比、血清和肺脏组织中炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。【结论】 穿王消炎粉可有效抑制LPS诱导的急性肺部损伤和炎症程度。