单细胞转录组测序技术发展及其在甘薯中的应用

单细胞转录组测序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）技术是在单个细胞水平通过对mRNA进行高通量测序研究其整体水平基因表达情况的一项新技术。本研究概述了scRNA-seq技术的发展历程和创新；详细介绍了scRNA-seq技术的单细胞捕获/分选、反转录/PCR扩增、建库测序和测序数据基础分析等步骤，以及在植物单细胞图谱、非生物胁迫响应机制、细胞分化发育、转录因子调控网络等研究中的应用；剖析了该技术在甘薯中单细胞图谱、分化、抗逆和基因方面的应用潜力；最后对该技术的应用进行了展望。     

单细胞转录组测序技术在动物肠道中的应用研究进展

高通量测序技术的发展是实现单细胞转录组测序的基石。高通量测序技术基于单细胞分辨率完成组织细胞分型、分析基因表达模式、揭示基因调控关系。文章介绍了3种单细胞转录组测序技术（10×Gnomics、Smart-seq2、Drop-Seq）的原理，阐明了微生物屏障、化学屏障、物理屏障和免疫屏障的组成和功能。通过单细胞转录组测序技术揭示动物肠道免疫的细胞异质性研究，以期为肠道健康的深入研究提供参考。     

基于单细胞转录组测序技术对鄂尔多斯细毛羊次级毛囊形态发生诱导期的研究

【目的】 试验旨在解析鄂尔多斯细毛羊胚胎期次级毛囊诱导期形态发生过程中主要细胞类型的分子特征和分化过程。【方法】 对采集的3只鄂尔多斯细毛羊（胎龄87 d）体侧部（肩胛骨后缘处）的皮肤样本进行HE染色，鉴定毛囊的发育时期；部分皮肤样本经过混样后进行单细胞转录组测序（scRNA-Seq），应用t-分布随机近邻嵌入（tSNE）分析细胞簇，分别使用胶原Ⅰ型α1链（Col1a1）和角蛋白15（Krt15）鉴定真皮谱系细胞和表皮谱系细胞，并使用皮肤组织不同细胞的标记基因进行细胞类型分析；对测序数据进行拟时序分析，探究其分化过程中差异基因的表达；通过GO功能富集分析进一步验证基因的功能。【结果】 HE染色结果发现，鄂尔多斯细毛羊在胎龄87 d处于次级毛囊诱导期。通过scRNA-Seq在胎龄87 d的细毛羊体侧部皮肤细胞样品中获得10 603个细胞和18 704个基因的scRNA-Seq数据可用于下游分析。tSNE分析发现，皮肤组织中共有15个细胞簇；Col1a1和Krt15标记基因鉴定表明，真皮细胞和表皮细胞具有高度异质性。拟时序分析构建毛囊形态发生过程中真皮/表皮细胞谱系细胞的分化轨迹和基因动态表达图谱表明，在真皮谱系细胞由成纤维细胞（Fb）向成熟真皮聚凝物（DC）的分化过程中，多个不同阶段的标记基因FST重组蛋白（Fst）、抑制素亚基βα（Inhba）和转录阻遏物GATA结合1（Trps1）均在拟时序轨道上特异性表达，并富集了Wnt、Noggin和骨形态发生蛋白（BMP）等与毛囊形态发生相关的信号通路；在表皮谱系细胞分化过程中，基质和毛囊间表皮（IFE）的标记基因角蛋白10（Krt10）、同源基因C13（HOXC13）和音猬因子信号（SHH）在表皮谱系细胞拟时序轨道的2个分支上均特异性表达，且富集在细胞增殖和细胞黏附等相关通路。【结论】 在细毛羊次级毛囊诱导期，真皮谱系细胞由成纤维细胞分化至真皮聚凝物，表皮谱系细胞处于基质和毛囊间表皮细胞增殖分化阶段，结果可加深人们对细毛羊次级毛囊形态发生过程的了解，为鄂尔多斯细毛羊育种研究提供有力的理论和技术支持。     

单细胞分析研究二氧化氯对杀蚊细菌球形赖氨酸芽胞杆菌芽胞的影响

球形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus sphaericus（Ls）是应用广泛的蚊虫生物防治制剂，在实际应用时可能会遇到不利的环境因子或杀菌剂。本研究通过单细胞分析方法监测ClO₂处理后的单个Ls芽胞及其萌发过程，探究ClO₂对Ls芽胞结构和成分的影响及与芽胞萌发相关蛋白的影响，以及ClO₂的杀胞机制。经0.05%～0.3% ClO₂处理5 min后，36%～86%的芽胞不能形成单菌落。吡啶二羧酸钙（CaDPA）特征峰（1017 cm^-1）强度随处理程度增大有所降低，而蛋白质α-螺旋峰（1652 cm^-1）强度没有明显变化。ClO₂处理显著改变Ls芽胞的萌发动态，芽胞启动CaDPA快速释放的时间、完全释放的时间以及皮层水解完成的时间显著延长；而外源CaDPA仅能触发低浓度ClO₂（0.05%）处理的芽胞，且显著迟缓。表明ClO₂处理没有直接破坏芽胞内膜但严重损伤了与萌发相关蛋白的功能，特别是皮层水解酶容易失活。这可能就是被处理的芽胞可以启动芽胞萌发的最初步骤，而不能进一步发展为营养细胞的原因。     

基于单细胞水平的孕二烯酮诱导雌性西部食蚊鱼雄性化的研究

【目的】从单细胞转录组水平研究雌性西部食蚊鱼（Gambusia affi nis）性别逆转过程中涉及到的 性腺细胞分化发育和基因表达变化，探讨孕二烯酮（Gestodene，GES）作用下食蚊鱼性别反转的分子机制。【方 法】将培养驯化 2 个月后的性成熟雌性食蚊鱼暴露于浓度为 500 ng/L 的孕二烯酮溶液中进行培养，于第 4、8 周 取样观察其形态变化，并分别取正常雌性对照、雄性对照、暴露 4 周和 8 周样本的性腺制成单细胞悬液，进行 单细胞转录组测序并分析。【结果】经孕二烯酮处理后的雌性食蚊鱼形态上出现臀鳍类生殖足现象。单细胞转 录组测序结果发现，雄性食蚊鱼和雌性食蚊鱼的性腺具有完全不同的细胞构成。雄性食蚊鱼性腺主要由成纤维 细胞、雄性生殖细胞、上皮细胞和原始生殖细胞构成，而雌性性腺主要由内皮细胞、成纤维细胞、卵母细胞和 原始生殖细胞构成。暴露 4、8 周后雌性食蚊鱼性腺中出现少量的雄性生殖细胞，且原始生殖细胞数量明显上升。 进一步分析发现，原始生殖细胞中性别决定关键基因出现差异化表达情况。细胞轨迹分析表明，部分原始生殖 细胞出现向雄性分化的特征，其中有 2 477 个基因在两个不同的分化方向表现出不同的表达模式。KEGG 通路富 集分析结果表明，Toll-like receptor、TGF-beta、Notch 等信号通路参与原始生殖细胞向雄性化逆转的过程，甘氨 酸，丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等途径也与该过程相关。【结论】雌 性食蚊鱼经孕二烯酮诱导后，在形态学上出现臀鳍雄性化特征，性腺中有部分原始生殖细胞向雄性生殖细胞转化。 原始生殖细胞中性别决定关键基因 amh、fabp3、dmrt1、wt1a、wt1b、cyp19a1a 和 fgf16 出现差异化表达情况。 Toll-like receptor、TGF-beta、Notch 和一些氨基酸代谢信号通路参与了原始生殖细胞向雄性化逆转的过程。