PRRSV-GP5基因的克隆及其B细胞抗原表位预测与分析

【目的】研究PRRSV-GP5基因B细胞抗原表位性质。【方法】根据Gen Bank上发表猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR技术,对阳性病料扩增回收,并将其克隆入p MD18-T载体中,送上海生工测序。应用生物信息学同源模型化的方法建立其PRRSV-GP5蛋白3D结构,并根据生物信息学软件DNAStar预测PRRSV-GP5蛋白的二级结构、表面可及性、抗原指数、亲水性及柔韧性,综合分析预测其B细胞抗原表位。【结果】结果表明,其肽段30-36、50-55、140-142、146-151和196-198可能是其优势B细胞抗原表位区域。【结论】该基因高度保守,PRRSV-GP5蛋白呈现较规则的空间结构,同时该结果将为PRRSV-GP5蛋白体外表达产物的应用和基因工程疫苗的研究提供理论依据。     

辽宁千山地区含cry8类基因的苏云金芽孢杆菌的分离、克隆与表达

QWH132、QZL1-2、QWH 7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101是笔者所在实验室从辽宁千山地区自行分离的含有cry8类基因的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),具有鞘翅目杀虫活性。本研究在6株菌株中成功发现并克隆了6个靶标生物为鞘翅目的 cry8类基因,其中被鉴定为cry8C类、cry8D类、cry8F类(大小为3 525 bp)、cry8K类的基因各有1个,被鉴定为cry8E类的基因有2个,其大小分别为3 534、3 495 bp。后4个基因已在GenBank注册,登记号依次为KC778983、KC778983、KC778984、KC778985。将6个基因插入pEB表达载体,经过PCR检测与SDS-PAGE分析证实它们能在大肠杆菌中进行异源表达,这6个基因的表达约有126~128 ku的蛋白,这些菌株中的Cry8蛋白为进一步发掘我国天然的苏云金芽孢杆菌资源与构建新的杀鞘翅目昆虫的高效工程菌提供了重要的试验材料与新思路。     

狂犬病病毒Flury-LEP株全基因组的克隆与序列分析

用RT-PCR法获得了涵盖狂犬病病毒Flury LEP株全基因组的3个重叠的cDNA片段,将获得的cDNA片段分别克隆至pMD18-T Simple载体上并进行序列测定,对测序结果进行拼接,得到全长cDNA序列,结果表明,Flury LEP株全长为11 924 bp,3-′UTR长58 bp,编码区核苷酸为11 723 bp,5-′UTR为131 bp。     

日本大耳白兔TLR3部分cDNA克隆及mRNA在组织中的分布

采用RT—PCR技术从日本大耳白兔的脾脏组织克隆出兔的Toll样受体基因3（命名为。TLR3），并对其mRNA在兔的17种组织中的分布情况进行了检测。结果显示，RTLR3核苷酸序列与GenBank中登载的穴兔（Oryctolagus cuniculus）TLR3序列（登录号：NM_001082219）相似性为100％；兔的胸腺、脾脏、睾丸等14种组织中检测出TLR3 mRNA的转录产物，而在骨骼、胃和皮肤中未能发现。推导的氨基酸序列同源性比对表明，兔TLR3与人、野猪、牛、猫、褐鼠等动物的同源性最高，为80％-85％；与原鸡同源性次之，为61％；与草鱼、绿河豚等同源性在45％～48％之间；系统进化树分析表明，兔TLR3与马的亲缘关系最接近，与猪、人／绵羊、牛、猩猩／猫的亲缘关系依次渐远，与鼠的亲缘关系最远。可见，TLR3在不同种属动物及不同组织中所起的作用具有生物多样性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

查明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)致病性大幅增高的机制,进而研制用于防治流行PRRSV变异株的高效疫苗无疑是兽医工作者的当务之急.在弱毒株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS以及我室构建的高致病性HP PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,构建了nsp2替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆.将构建的嵌合克隆转染MA104,4d后观察到典型的CPE.通过RT-PCR和免疫荧光证明获得了一系列强弱毒株之间的嵌合病毒.这些嵌合病毒的构建成功和相应反向遗传操作平台的建立及应用,为研发预防HP PRRSV的高效嵌合疫苗奠定了基础.该类嵌合感染性cDNA克隆也为解析目前流行的HP PRRSV毒力因子和高致病力机制奠定了基础.     

猪蓝耳病病毒CH-1R株高敏感性Marc-145细胞株的克隆与产毒试验

Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞.为了进一步提高PRRSV CH-1R弱毒疫苗株在Marc-145细胞中的增殖水平,试验采用有限稀释法对Marc-145细胞进行克隆.结果表明,克隆后获得的Marc-145/D2细胞株对CH-1R弱毒株具有更高的敏感性.     

宠物克隆及应用前景

世界上第一只体细胞克隆猫CC于2002年由美国科学家克隆成功。从此开辟了宠物克隆市场，并最终形成了克隆宠物的国际性行业。韩国是世界上唯一成功克隆狗的国家，于2005年利用体细胞核转移技术克隆出世界上第一只克隆狗“斯奴比”，并于2009年开发出用脂肪组织的干细胞克隆狗的新技术。克隆宠物的成功，使宠物主看到了逝去的爱狗、爱猫。也使商家看到了巨大的潜在商业价值。宠物克隆在美国已经被商品化，很多人对于克隆宠物伦理道德问题的关注超过对商业价值的关注。克隆，成为20世纪最重大也是最有争议的科技突破之一。     

萨能奶山羊乳腺组织5-HTR4基因的克隆序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计5-羟色胺受体4(5-HTR4)一对克隆引物,对萨能奶山羊乳腺组织中5-HTR4进行克隆、测序,并进行分析;再根据克隆序列设计引物,从重组克隆载体中扩增出含Bam HⅠ/XhoⅠ酶切位点的5-HTR4片段,酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-5-HTR4,经IPTG诱导进行表达、鉴定。奶山羊5-HTR4基因的ORF与兔(Z50162)、猪(NM-001173418)、人(human5HT1D)、狗(NM-001003280)和鼠(AK082016)的同源性分别为46.1%、47.2%、78.9%、45.8%及89.8%。Smart分析发现,奶山羊5-HTR4基因推测氨基酸序列信号肽与人、鼠5-HTR4基因氨基酸序列信号肽均为1～23aa,SapB结构域均为49～126aa,结构特征与人、鼠的5-HTR4结构特征相一致。     

鸡CD4蛋白基因的克隆及其mRNA在淋巴器官中的表达

从鸡胸腺、脾脏、哈德氏腺、外周血液和法氏囊等免疫器官中分离淋巴细胞,应用RT-PCR对这些免疫器官中鸡CD4分子mRNA的表达进行了研究。同时,用RT-PCR对鸡脾淋巴细胞CD4分子cDNA进行了克隆和序列测定。结果表明,在上述器官中,法氏囊淋巴细胞不表达鸡CD4分子mRNA,其他器官中均有表达。通过序列分析表明,本试验扩增得到的基因为编码鸡CD4分子的基因。