三角帆蚌内脏团培育圆形有核珍珠的试验

报导了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)内脏团培育圆形有核珍珠的试验结果。结果显示:插植珠核的7362只手术蚌植核后一个月内成活率99.2%。经23个月养殖后,随机抽取50只。结果留核率达94%,成珠率为86%,其中中高档珠占37.2%。有核珍珠直径在9.4~11.6 mm之间,其中10 mm以上占88.4%。11.6%的珍珠表面有小于3 mm的凸起,未发现带扁而长尾巴的珍珠。试验表明:三角帆蚌内脏团内能培育出高品质的有核珍珠。此外还发现,脱核或核片分离的细胞小片仍可在内脏团内形成珍珠。     

三角帆蚌新发现的贝壳基质蛋白基因hic9的分离、鉴定及其在珍珠早期形成过程中的作用

为进一步研究珍珠质形成的分子机理,使用RACE-PCR技术从三角帆蚌外套膜中克隆到一个新的贝壳基质蛋白基因hic9。RT-PCR和原位杂交技术结果显示,hic9主要在闭壳肌和外套膜中表达,且在外套膜外褶的外表皮各部分都有信号,在壳皮沟中同样有信号,这些结果表明,hic9是一个同时参与了贝壳角质层、棱柱层和珍珠层形成的多功能基质蛋白基因。hic9富含甘氨酸(14.81%)、脯氨酸(13.58%)和丙氨酸(12.35%),在序列中部形成"Gly-X-X"的结构(X为任意氨基酸),与近C末端连续重复丙氨酸结构(polyA)一起使hic9具有类似蛛丝蛋白的结构特征。hic9 C末端由一段疏水性序列"LAWMLFV"组成,推测这段序列形成β折叠结构,紧邻该序列89～91位是"Asp-Leu-Asp"序列,这是一个典型的Ca2+结合位点。此外,通过实时定量PCR检测了珍珠形成早期阶段hic9在初生珍珠囊中的表达情况,插片后3～15 d hic9在珍珠囊中的表达水平维持在大致相同的表达水平,在碳酸钙沉积物从无序向有序转变时期(18～25 d),表达水平较第15天有显著的升高,这表明hic9参与了这一过程,在珍珠层的形成过程中发挥了关键作用。     

基于16SrDNA比较研究混养三角帆蚌和鲢鳙对池塘养殖水体微生物群落结构的影响

为了研究混养三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和鲢(Hypophthalmichthys molitrix)鳙(Aristichthys nobilis)对池塘养殖水体微生物群落结构的影响,分别在浙江海盐、江西九江、上海浦东开展了罗氏沼虾-三角帆蚌混养、草鱼—三角帆蚌混养、罗氏沼虾-三角帆蚌-鲢鳙鱼混养三组系列实验。利用DGGE技术对养殖水体的16S r DNA进行指纹图谱分析。三组实验共鉴定出57条不同条带,每组实验中混养三角帆蚌或鲢鳙实验组的平均条带数均高于单养水体水样平均条带数。Shannon多样性指数分析结果显示,各养殖水体混养三角帆蚌、鲢鳙后,多样性指数均有所增加。PCA分析和DGGE聚类结果显示,在无鲢鳙的情况下,蚌与主养物种(罗氏沼虾、草鱼)混养实验组的16S r DNA图谱聚为一类,显示出蚌对于微生物群落结构影响的贡献;在同时引入鲢鳙和蚌的情况下,16S r DNA指纹图谱则是按照有无鲢鳙聚为两类,提示在本实验中鲢鳙对于水体微生物的影响要大于蚌。对DGGE图谱其中20条显著条带进行回收、测序和系统发育分析,结果表明,所获序列主要分属于放线菌门(Actinobacteria,25%)、蓝藻门(Cyanobacteria,25%)、α-变形菌亚门(Alphaproteobacteria,15%)、β-变形菌亚门(Betaproteobacteria,15%)、γ-变形菌亚门(Gammaproteobacteria,10%)、ε-变形菌亚门(Epsilonproteobacteria,5%)、裸藻叶绿体(Euglenales,5%)。     

三角帆蚌蚌瘟病原的初步探讨

探讨了三个水产场三角帆蚌大批死亡的病因。取病料经匀浆、离心后取上清液,再经青霉素、链霉素处理或微孔滤膜过滤除菌,人工感染健康三角帆蚌均能引起发病死亡,并能连续传代。其症状和病理解剖变化与自然发病的蚌相似。病原病毒粒子有囊膜,核衣壳呈二十面体对称,大小80～120nm,暂称为蚌的类疱疹病毒。含毒病料置50％甘油磷酸盐缓冲液中,在0～4℃冰箱保存6个月,-20℃低温冰箱中保存一年半,仍有致病力。     

三角帆蚌消化系统扫描电镜观察

三角帆蚌消化系统扫描电镜观察欧阳珊，吴小平，邓宗觉，刘月英（南昌大学，３３００４７）（中科院动物研究所，北京１０００８０）关键词三角帆蚌，消化系统，扫描电镜ＳＥＭＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＯＮＴＨＥＤＩＧＥＳＴＩＶＥＳＹＳＴＥＭＯＦＨＹＲＩＯＰＳＩＳＣＵ...     

池蝶蚌组织蛋白酶L1-like基因的克隆及表达特征分析

为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长c DNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的c DNA全长,命名为Hs Cts L1-like基因(Gen Bank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5′-非翻译区(5′UTR)为31 bp,3′-非翻译区(3′UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,Hs Cts L1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的Cts L签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在Hs Cts L1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏Cts L1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌Cts L(ADV03094)和池蝶蚌中另一个Cts L(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,Hs Cts L1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的Cts L1聚为一分支,推测Hs Cts L1-like属于Cts L家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测显示,Hs Cts L1-like m RNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏Hs Cts L1-like m RNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。     

三角帆蚌疾病流行病学研究

1994—2002年，通过对1695个蚌病病例流行病学资料的收集、临床诊断以及病理学、病原学检查，基本探明了蚌病的主要寄生性和细菌性病原生物，同时发现了腔肠动物等主要敌害生物；初步提出了三角帆蚌疾病种类及其相应发病率。蚌病与鱼病的周年流行规律有明显不同，每年的3—9月为蚌病高发期，与三角帆蚌月龄亦有相关性：手术接种后1～2个月，14～15个月，20～23个月为明显的蚌病高发阶段。统计结果还表明蚌病发生与手术消毒、施肥等日常管理操作．及水体生态环境密切相关。蚌病一般呈“亚急性”或“慢性”型，不应统称为“蚌瘟”病。忽视寄生虫危害的严重性，可能是蚌病防治难的重要因素。     

鲢、鳙对三角帆蚌池塘藻类影响的围隔实验

以浙江金华汤溪威旺养殖基地的三角帆蚌养殖水体为研究对象,通过围隔实验比较研究了单养鲢、鳙和三角帆蚌的池塘浮游植物密度、生物量和优势种(属)组成等的差异,以及养蚌池混养鲢鳙对水体浮游植物密度、生物量以及优势种变化的影响。结果表明,养蚌(10#)围隔的浮游植物平均密度和生物量均显著高于高密度鲢(12#)围隔(P<0.05),其蓝藻数量及生物量显著高于高密度鲢(12#)和低密度鳙(13#)围隔(P<0.05),绿藻数量则显著低于低密度鲢单养(11#)围隔(P<0.05)。在鱼蚌混养的情况下,单养蚌(10#)围隔浮游植物平均数量显著高于鲢-蚌混养(15#,16#)和鳙-蚌混养(17#,18#)围隔(P<0.05),其蓝藻数量及生物量极显著高于鲢-蚌混养(15#,16#)或鳙-蚌(17#,18#)围隔(P<0.01),其绿藻数量显著低于混养高密度鲢(16#)或低密度鳙(17#)的混养围隔(P<0.05)。研究结果充分说明,鲢、鳙和三角帆蚌三者对水体藻类组成的影响有别,三角帆蚌养殖池中适当混养鲢或鳙可以有效控制蓝藻(铜绿微囊藻)的生长,促进绿藻(四尾栅藻)的生长,并最终有利于三角帆蚌的养殖,混养鲢密度的增加有利于控制藻类生长,而鳙密度的增加促进了裸藻等中大型藻类的生长。     

两个三角帆蚌选育品系珍珠层颜色与外壳色L*a*b*值及其相关性分析

运用色差仪获得了两个三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)选育品系珍珠层颜色与外壳色的颜色参数L、a和b值,对各颜色参数进行了相关分析和回归分析,探索珍珠层颜色与外壳色之间的相关性。结果显示"紫皇后"珍珠层颜色与外壳后部颜色具有相关性,它们的L、a和b值均显著相关,相关系数分别为-0.456、0.371和-0.426,建立了"紫皇后"珍珠层对外壳后部各颜色参数的回归方程为L:y=80.49-0.53x(R~2=0.208),a:y=3.60+0.21x(R~2=0.137),b:y=4.69-0.35x(R~2=0.181);"白贵妃"珍珠层颜色与外壳后部颜色的L、a和b值显著或极显著相关,相关系数分别为-0.444、0.477和-0.390,表明"白贵妃"珍珠层颜色与外壳后部颜色显著相关,建立珍珠层对外壳后部各颜色参数的回归方程分别为L:y=87.36-0.21x(R~2=0.197),a:y=-1.77+0.23x(R~2=0.228),b:y=2.10-0.22x(R~2=0.152)。通过逐步判别分析获得了外壳色的2个参数(b和a),并构建了区分2个选育品系的判别函数:"紫皇后"的判别公式为YQ=1.786X1-0.384X2-4.440,"白贵妃"的判别公式为YW=0.321 X1+0.600 X2-4.763,综合判别率达90.0%。显示2个选育品系的外壳色差异非常明显,可通过判别分析进行可靠的区分。结果表明,对三角帆蚌外壳色的量化分析,可以对内部的珍珠层颜色进行可靠区分并进行量化推断。     

三角帆蚌Rab3 cDNA全长克隆及其原核表达

根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术获得三角帆蚌Rab3基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ190954）。序列全长1707 bp,开放阅读框666 bp,编码221个氨基酸,5’端非编码区为158 bp,3’端非编码区为883 bp。软件推测其编码蛋白相对分子量为24.92 KDa。NCBI Blastp进行氨基酸序列同源性分析表明,与居蟹皮海绵（Suberites domuncula）的Rab-3like（SdRab3）氨基酸相似性最高,为64%,构建进化树的结论也是先与居蟹皮海绵的Rab3-like（SdRab3）聚为一支。根据获得的Rab3基因cDNA全长序列,设计特异性引物扩增获得完整开放阅读框序列,并将已克隆到的三角帆蚌Rab3开放阅读框定向插入原核表达载体PQE-His质粒中,转化大肠杆菌BL21（DE3）。在30℃,5 h,1 mM IPTG的诱导条件下,Rab3蛋白得到高效表达,重组菌体经裂解和SDS-PAGE电泳分析,发现一条26 kDa左右特异的蛋白表达条带,其表达量约占菌体总蛋白30%。Western-blot检测表明,在健康组和病变三角帆蚌肝脏中,Rab3蛋白与β-actin的表达量比值分别为0.438和0.580。这一结果说明,Rab3基因在三角帆蚌经病原菌侵染后,表达量上调,且已有研究表明Rab3有通过调节中性粒细胞的胞吐作用来抵抗细菌侵入、防止机体感染的功能,从而初步推测三角帆蚌Rab3蛋白可能与三角帆蚌瘟病有关。