水稻品种日本晴粳稻组培培养基的筛选及转稻瘟菌蛋白激发子基因植株的获得

采用B6、MS和NB 3种培养基,以粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴的成熟胚为受体材料进行组织培养,比较了3种培养基的效果.结果表明,在3种培养基中,NB培养基对愈伤组织的诱导效果最好,转化效率最高,最适合于日本晴成熟胚的组织培养.在此基础上,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)导转化法将稻瘟菌蛋白激发子基因pcmG1导人日本晴基因组,获得了转基因水稻植株.PCR、Northern blot和Western blot分别证实了pcmG1基因的整合、转录和表达.遗传分析表明,外源基因在转基因日本晴后代中的分离符合3:1的理论比例.     

水稻条斑病细菌类Harpin蛋白的纯化与特性研究

 用硫酸铵沉淀、制备等电聚焦电泳、阴离子交换层析等方法从水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xooc) RS105菌株突变体M51菌体破碎液中纯化出可激发烟草产生过敏性反应(hypersensitive response,HR)的蛋白类物质,分子量约为25.5 kDa。该物质与梨火疫病菌(Erwinia amylovora))的HarpinEa和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)的Harpin_Xoo具有相似的生物活性和理化特性:可激发烟草产生典型的HR反应;对热稳定,对蛋白酶K敏感;RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂环己酰亚铵和钙离子通道阻断剂氯化镧能够抑制该物质激发烟草产生HR;该物质具有诱导烟草抗TMV的功能。据此,将该物质命名为类Harpin蛋白(Harpin-like protein,HLP_Xooc)。     

微生物蛋白激发子PeaT1的获得及诱导水稻抗旱性的初步研究

PeaT1是来源于极细链格胞菌（Alternaria tenuissima）的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和提高抗逆性的功能。为了进一步研究该激发子的功能,构建了表达该蛋白质的原核表达载体pET28a-peaT1,诱导表达获得大量目的蛋白质。利用AKTA蛋白质纯化系统,通过亲和层析、离子交换层析和分子筛等纯化技术,获得高纯度的PeaT1蛋白。用不同浓度的纯化蛋白处理水稻,进行抗旱性检测,结果表明PeaT1可明显提高水稻的抗旱性。     

Flg22诱导的海带（Saccharina japonica）孢子体防御反应的初步研究

以鞭毛蛋白N端一个保守的22个氨基酸多肽(flg22)为激发子,研究其诱导海带孢子体防御反应的特征,以丰富植物分子病理学理论.采用Evans blue染色方法发现,flg22诱导后2h内,未能观察到海带孢子体细胞死亡现象,诱导后4～10 h,观察到大量死亡的细胞.TUNEL(TdT-mediated dUTP-biotin nick and labeling)检测方法证实,受flg22诱导后海带孢子体有DNA断裂现象,而且3’-OH末端断裂的数量随诱导时间的延长而增多,并有从诱导部位向外扩散的趋势.运用Luminol荧光检测方法检测到受flg22诱导后海带孢子体H2O2释放量迅速增加,至3h时达到峰值,约为20 μmol/L.应用荧光染料2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)进行ROS组织学检测,发现flg22诱导后1h即观察到绿色的荧光信号,信号强度随诱导时间的延长而增加,诱导后3h信号最强,随后绿色荧光信号的强度逐渐减弱.ROS的产生趋势与Luminol荧光检测方法的结果相一致.结果表明,flg22也是诱导海带孢子体防御反应的有效激发子.     

提高红曲霉发酵产品Monacolin K含量的研究

采用物理、化学及生物的方法均能有效提高红曲产品Monacolin K的含量。其中,UV和LiCl复合诱变Monascus purpureusZZ红曲菌,获得Monacolin K的含量比对照高3倍,其诱变和原始出发株的液体摇瓶发酵单位分别是219.9μg/mL和65.4μg/mL;采用优质大米培养基质及优化发酵培养条件使其Monascus purpureusGX红曲菌发酵的红曲米Monacolin K含量高达14.54 mg/g,比对照2.65 mg/g提高近6倍;尤其在红曲培养过程中添加真菌激发子,一种担子菌的无性型液体发酵物Hxa能明显提高Monascus purpureusZZ液态及固态发酵产品Monacolin K含量达1330.4μg/mL和34.99 mg/g,分别为原始出发株65.4μg/mL和2.48 mg/g的20倍和17倍。     

稻瘟菌糖蛋白激发子CSBⅠ纯化过程的优化

利用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100对来源于稻瘟菌(Magnaporthe grisea)ZC13菌株97-151a菌丝细胞壁的糖蛋白激发子CSBⅠ进行纯化过程的优化。离子交换层析条件的选择结果表明:弱阴离子柱DE-AE-Sepharose FF和Tris-HCl缓冲体系的洗脱效果较好。新的步骤是:选用YM30膜超滤,省略ConA-Sepha-rose 4B亲和层析,粗激发子过凝胶柱Sephacryl S-100,阴离子柱DEAE-Sepharose FF,获得的活性峰D3,即为纯化的CSBⅠ。随着激发子的逐步纯化,其诱导不同水稻品系叶片中的POD比活相应显著升高(P<0.01),CSBⅠ的诱导活性最高。该纯化方法简便,重现性稳定,提高了纯化效率。     

植物激发子及其信号传导之研究进展

植物诱导抗病性是当前科学研究的热点,是研究病源物和植物互作关系的关键。植物激发子在植物诱导抗病性中发挥着重要的作用,它是一类能诱导寄主植物产生防卫反应的特殊化合物,在与受体分子结合后,通过一定的信号传导途径激发植物产生防卫反应。综述了近年来激发子在植物诱导抗病性中的研究进展,包括激发子的种类,受体类型以及激发子引起的信号传导,并对激发子研究存在的问题及应用前景进行了展望。     

表达的hrmA蛋白质具有诱导水稻细胞产生防卫反应的活性

 将丁香假单胞菌hrmA基因构建到原核表达载体pET 29中,得到重组载体pET hrmA。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得了以包含体形式存在的融合蛋白。复性的融合蛋白能诱导水稻悬浮细胞的活性氧迸发,处理20min后达到峰值。Northern杂交结果表明hrmA蛋白能显著地诱导PBZ1基因在水稻悬浮细胞中表达,在所观察的时间内PBZ1基因表达丰度随处理时间延长而增加,用hrmA处理水稻植株,诱导了PAL基因的表达。实验结果表明hrmA融合蛋白具有激活水稻细胞防卫反应的活性。     

棉疫病菌90kD胞外蛋白激发子生物活性与稳定性研究

 对棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae Saw.)90 kD胞外蛋白激发子的生物活性与稳定性进行了研究。用不同浓度的激发子处理烟叶测定其诱发过敏反应的有效浓度,结果是所测定的0.5~100 nmol/L各浓度均可诱发过敏反应,但100 pmol/L不能诱发过敏反应,表明该激发子诱导烟草产生过敏反应的最低有效浓度在100 pmol/L~0.5 nmol/L之间。该激发子可诱导不同烟草(Nicotiana tabacum L.)品种产生过敏反应,但不能诱导辣椒(Capsicum annuum L.)和茄子(Solanum melongena L.)等茄科作物及棉花(Gossypium arboreum Linn.)发生过敏反应,初步表明该激发子诱导植物发生过敏反应具有一定的专化性。以10 nmol/L激发子溶液处理烟叶后分别于第0、24、48和72 h接种烟草疫霉(Phytophthora nicotianae),结果证明该激发子可以诱导烟草产生抗性反应,其抗性以处理后立即接种烟草疫霉为最强,接种后48h防效达68%,以后随时间的延长逐渐减弱。激发子分别经p H值2~14的水溶液25℃处理30 min,或分别经4、25、60和100℃处理5 min仍能诱发过敏反应,但是经蛋白酶K处理后不能诱发过敏反应。表明该激发子对酸、碱和温度不敏感,但对蛋白酶K敏感。