伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

哺乳动物卵母细胞非整倍体产生机制的研究进展

雌性生殖细胞进行减数分裂时易发生染色体分离错误而产生非整倍体卵母细胞,其受精后会产生非整倍体胚胎,导致出生缺陷或胚胎致死,是影响哺乳动物繁殖的重要因素。卵母细胞在第一次减数分裂前期发生同源染色体联会,此时DNA双链断裂引发重组。重组时缺乏交叉、重组事件数量的减少及交叉靠近端粒或着丝粒导致染色体发生同向分离或不分离,从而产生非整倍体卵母细胞。减数分裂期间,当染色体的端粒共向于同一极或没有完全附着在纺锤体微管上时,纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint,SAC）被激活,E3泛素连接酶APC/Cyclome （APC/C）沉默,保护分离酶抑制蛋白（securin）和细胞周期蛋白B （cyclin B）不被降解,从而抑制分离酶和染色体的分离。直到所有染色体与纺锤体实现稳定的双极定向并正确排列到赤道板上,SAC关闭,染色体正确分离。卵母细胞中SAC蛋白缺失,导致SAC不能有效地监测端粒在纺锤体上的正确附着,发生染色体分离错误,从而产生非整倍体卵母细胞。因此,通过现代分子技术手段解析非整倍体卵母细胞所涉及的机制是保护哺乳动物生育的重要目标。作者主要介绍了卵母细胞减数分裂的特点,详细阐述了卵母细胞非整倍体发生的染色体分离错误的分子机制,以期为开发卵母细胞非整倍体的治疗手段提供参考。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

2020年新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测与分析

为了解2020年新疆地区猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）抗体水平及其消长规律,本试验采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法对1 218份血清中PRRSV免疫抗体水平进行检测和分析。结果显示,PRRSV抗体平均阳性率为78.49%（956/1218）,高于国家规定标准（70%）。S/P的平均值为1.22±0.84,变异系数为69.45%。不同类别猪群抗体平均阳性率在59.19%~91.50%之间,有一定的差异。在调查的10个规模化养殖场中,9个场PRRSV免疫抗体阳性率达到国家标准。不同类别猪群PRRSV变异系数较高,需进一步对现有的免疫程序进行调整和完善,确保各猪群健康。     

2019—2020年新疆部分地区猪PCV2的抗体水平检测及分析

为了解2019—2020年新疆地区猪圆环病毒病2型（PCV2）抗体水平及其消长规律,本试验采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对475份血清中PCV2免疫抗体水平进行检测和分析。结果显示,PCV2抗体平均阳性率为69.68%（331/475）,未达到国家规定标准（70%）。S/P的平均值为1.56。不同类别猪群抗体平均阳性率在42.50%~86.67%之间,有一定的差异。在调查的5个规模化养殖场中,仅有2个场PCV2免疫抗体阳性率达到国家标准。各场应根据抗体检测结果,进一步对现有的免疫程序进行调整和完整,确保各猪群健康。     

猪丹毒和猪肺疫混合感染综合诊治

疫病一直是生猪养殖中影响猪群健康的重要因素,受到疾病影响的猪群会给养殖户带来巨大的经济损失,严重阻碍养殖业的发展。该文将简要概述猪丹毒和猪肺疫的病理状况,分析猪丹毒和猪肺疫混合感染的发病特征和临床症状,并研究综合诊治猪丹毒和猪肺疫混合感染的方法,降低猪丹毒和猪肺疫混合感染对生猪养殖的影响。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

Analysis on Differential Expression Genes in Porcine Aortic Vascular Endothelial Cells Induced by Apolipoprotein C Ⅲ

The aim of this study was to investigate the differential expression genes induced by ApoCⅢ,and study the function of ApoCⅢ.Porcine aortic vascular endothelial cells were successfully isolated using enzyme digestion,and then screened the differential expression genes induced by ApoCⅢ using the Solexa high-throughput sequencing technology.The results showed 647 differential expression genes,including 390 up-regulated genes and 257 down-regulated genes.The qRT-PCR results verified that the gene expression results from Solexa sequencing data were reliable.GO and Pathway analysis showed that the function of differential expression genes were related to immune response,cell apoptosis and death.These findings suggested that ApoCⅢ affected the physiological function of porcine aortic endothelial cells by the molecular pathways of inflammation,cell adhesion and apoptosis,which provided a theoretical basis for further understanding the molecular mechanisms of atherosclerosis caused by ApoCⅢ.