Genetic Polymorphism of Kappa Casein （K-CN）in Iraqi Buffalo Using Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism

This study was carried out the animal production department, genetic engineering lab, college of agriculture, （UoB）, Iraq. The aim of this study was to use the polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） as a fast, efficient and low cost method to detect the genetic variants of kappa-casein gene （k-CN） in Iraqi buffalo using three different primers specific for bovine k-CN to amplify the gene segment, followed by digestion using restriction enzyme （Hind III） for genotyping. DNA from 50 Iraqi buffaloes was extracted by phenol chloroform method. PCR was carried out in a final reaction volume of 25 μL and the reaction mixture was subjected to standard PCR protocol. The results of this work show that among the examined 50 Iraqi Buffalo were homozygous for the K-CN and genotyped as BB for all three primers but gave different bands. Thus PCR-RFLP using Hind III revealed all the samples to be monomorphic for this locus. The restriction digestion analysis of 397 bp PCR product of k-CN indicates the presence of two fragments of 154 bp and 225 bp for BB-genotype. A 437 bp fragment of the bovine genomic K-CN gene was amplified. One Hind III restriction site is found in position 346 of the amplified fragment of allele k-CN B, yielded 91 bp and 346 bp. Amplified products from Iraqi buffalo （530）, after being digested with Hind III, yielded two separate DNA fragments of different sizes i.e., 160 bp and 370 bp. For the first time completed research such specifications in Iraq, for the first time using molecular biology in genetic identification. Our objectives of this study have been to aid in understanding domestication, Buffalo origin and their history and evolution, to identify genetically unique breeds, to provide an objective basis for conservation decisions and to aid the formulation of breeding plans.     

植物检疫性有害生物蔗扁蛾的PCR快速鉴定

基于PCR分子检测技术,建立了进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾(Opogona sacchari)快速、准确的鉴定方法。该方法对待检样品的基因组DNA经PCR扩增后进行凝胶电泳图分析,实现对待检样品的准确鉴定,检测时间缩短至8 h内,检测基因组DNA质量浓度限度为1 ng/μL,最适检测限为10 ng/μL以上。     

猪嵴病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus) 3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法.反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93％.利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1 pg.利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3％,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高.     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速、鉴别诊断方法,根据GenBank中已发表的2种病毒的基因组序列,选择病毒的保守基因各设计了一对特异性检测引物,建立了可以同时鉴别检测猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的双重RT-PCR方法.该方法能从猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒分别扩增出310 bp和161 bp的特异性片段,对2种病毒混合基因组同时扩增出310 bp和161 bp的特异性片段;该方法对猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;该方法最低可以检出0.2 pg病毒RNA含量.本研究建立的RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,在一个PCR反应体系中就可以准确、快速鉴别检测出猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,可以用于临床病料的快速检测.     

猫细小病毒的分离与鉴定

为丰富猫细小病毒(FPV)流行病学资料和制备灭活疫苗,通过猫肾传代细胞(F81)培养方法从疑似感染FPV病猫粪便中分离病毒.对分离到的病毒进行理化性质分析和FPV特异性检测引物PCR鉴定,然后对FPV的VP2基因进行扩增测序.理化性质分析结果与FPV特性均相符,VP2基因测序结果与GenBank已发表的FPV标准株VP2基因序列对比分析,核苷酸序列同源性达到99.0％,证明该分离毒株为猫细小病毒.该毒株的成功分离进一步充实了我国FPV病毒库,也为灭活疫苗的制备奠定了基础.     

海南发现2株新德里金属β-内酰胺酶-1 阳性的阴沟肠杆菌

为了解临床分离的携带新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）基因的阴沟肠杆菌耐药性,笔者采用法国生物梅里埃公司的VITEK-2全自动细菌分析系统对临床分离的2株阴沟肠杆菌进行了鉴定,用IP／IPI E-test试纸条法协同试验检测了产金属酶类的碳青霉烯酶,用浓度梯度E-test条法进行药物敏感性试验,并对PCR产物进行电泳后纯化,测序比对确定基因型。结果表明,2株阴沟肠杆菌均携带β-内酰胺酶6如MDM-1基因,对美洛培南、亚胺培南、哌拉西彬他唑巴坦、头孢替坦、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、复方新诺明、阿米卡星等均有耐药性。由于分离出这2株携带NDM-1基因的阴沟肠杆菌的患者都是海南省居民,从未有国外旅行史,说明与国外报道的NDM-1肠杆菌科细菌没有流行病学关联,这对了解该基因在海南地区的流行情况具有重要意义。     

伪狂犬病病毒gG—gD基因片段的扩增及克隆和序列测定

以伪狂犬病病毒（PRV）HB－9304株的基因组为模板，利用聚合酶链反应（PCR）对其gG-gD基因片段进行扩增，获得了预定大小的片段，将这一片段克隆到质粒载体pPK中。对重组质粒pPKGD进行限制性内切酶分析、PCR鉴定和克隆片段的序列测定，证实了克隆片段的可靠性。     

聚合酶链反应(PCR)法检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因

根据已报道的鱼源嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列设计和合成了 1对可扩增目的片段长度为 893bp的引物 ,建立了检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因 PCR方法。脱脂奶平板产溶蛋白圈的 10株鱼源嗜水气单胞菌株以及 ATCC796 6检测均为阳性 ,检测的灵敏度可达 2 .0× 10 - 3g/ L的模板 DNA。表明 PCR法在分子水平快速、特异检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶并可作为流行病学调查的手段     

聚合酶链反应检测鉴别鸡毒霉形体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒霉形体(MG)强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点，分别设计合成2对引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ16，建立了可检测MG强、弱毒株的PCR方法。以引物XZ1、XZ2对MG强毒株和弱毒株进行的PCR，均可扩增出732bp的特异性片段；而以另1对引物XZ45、XZ46对MG弱毒株进行PCR，可扩增出524bp的特异性片段，但对鸡毒霉形体标准强毒株和野毒株的PCR，则扩增不出任何条带。特异性试验表明，这2对引物对其他种类鸡毒霉形体及其他对照禽病病原核酸模板的扩增均为阴性。敏感性试验结果显示，2对引物PCR均能检出100fg的MGDNA。研究结果表明，通过上述2对引物的2次PCR扩增，在数小时内即可鉴别出MG毒株是强毒株还是弱毒疫苗株。