两种半纤维素酶在毕赤酵母中的共表达

基于定向改造的木聚糖酶(DSB)和甘露聚糖酶(ManA),通过不同的整合位点和抗性标记实现这两种酶在同一宿主GS115中的整合与筛选,获得了共表达菌株GS115/DSB-ManA。其热稳定性检测结果表明,该共表达菌株产出的DSB与ManA均有较高的热稳定性。重组菌株两种酶的成功表达为复合酶制剂的研究和生产奠定了基础。     

新城疫病毒F48E9株F-HN蛋白融合基因在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接新城疫病毒F蛋白基因和HN蛋白基因,并将构建好的融合基因克隆到载体pET28a,经测序后融合基因插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOX I和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白F-HN.重组质粒pPIC9K-F-HN经Sac Ⅰ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到转化...     

一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

毕赤酵母表达铜锌超氧化物歧化酶中试工艺研究

正交设计优化铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母在摇瓶及30L发酵罐的诱导表达条件,用两步层析法纯化表达的目的蛋白,在不同温度下进行原液稳定性试验。用考马斯亮蓝检测蛋白含量,活性检测试剂盒检测目的蛋白活性。纯化后原液参照中华人民共和国药典三部2005版进行检测,用SDS-PAGE、HPLC检测纯度,免疫印迹法检测rhCu,Zn-SOD特异性,等点聚焦测定该酶等电点,地高辛法检测残余DNA含量,酶联免疫法测定残余蛋白含量。结果显示正交试验的大罐高密度发酵最适条件比摇瓶的最适条所获得的目的蛋白活性高8倍,纯化后,HPLC纯度为99.7%,原液比活性大于6.0×103 U/mg,各项检测指标达到生物制品检定标准。该酶在45、65、85、100℃的半衰期分别为240、120、30、15。具有良好的酶稳定性。本研究建立了发酵、纯化的中试工艺,获得高表达、高纯度及高比活的铜锌超氧化物歧化酶,为规模化生产奠定了基础。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26的毕赤酵母组成型分泌表达

近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

构建了枯草芽孢杆菌CH_2菌株(Bacillus subtilis CH_2)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结果显示,重组壳聚糖酶的分子量为29 k D,粗酶的比酶活达到133.60 U/mg,纯化后重组蛋白的比酶活为338.08 U/mg;该酶的最适作用温度为50℃,最适pH为4.5,酶动力学常数Vmax=24.39(μmol/mg)·min~(-1),Km=5.48 mg/m L;Fe2+、K+等对其酶活力有一定的激活作用,其中Mn~(2+)能使酶活力提升2.4倍,Ag~+、Mg~(2+)、Hg~(2+)、EDTA、EGTA和SDS等存在时则对其酶活力有强烈抑制作用。利用重组壳聚糖酶酶解壳聚糖,酶解产物主要为聚合度2~10的壳寡糖,且分布均匀。以上结果表明,枯草芽孢杆菌CH_2菌株壳聚糖酶基因在毕赤酵母GS115中成功表达,获得了一种内切型的高酶活力重组壳聚糖酶,该重组酶具有反应条件温和、酶解产物均一等特点,可被应用于海洋甲壳质加工应用中。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。