纤细齿梗孢丝氨酸蛋白酶cDNA克隆及其序列分析和表达

纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp（GenBank登录号为EU368754）,编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。     

重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化研究

[目的]研究重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化.[方法]通过设计、构建Jztx-Ⅲ/pPIC9k表达载体,经电转化、甲醇诱导后使敬钊毒素在毕赤酵母GS115中进行表达,并利用C-端6×His标签进行分离纯化.[结果]Jztx-Ⅲ可以在毕赤酵母GS115中高效表达,经亲和层析纯化后其产量可达到95 mg/L.[结论]该试验结果解决了敬钊毒素资源有限产量较低的问题.     

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1在毕赤酵母中的表达与酶活分析

 为了探究大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1(exoglucanase)的酶活与催化机理,本研究在生物信息学分析的基础上,以大丽轮枝菌V991菌株为材料克隆了VdCBH1基因,进一步构建了pPIC9-VdCBH1重组质粒并转入毕赤酵母中进行表达,测定了重组VdCBH1蛋白的外切葡聚糖酶活性;将预测的VdCBH1催化残基位点进行突变,随后通过SDS-PAGE分析了重组VdCBH1蛋白及其催化残基位点突变蛋白的表达情况,并检测了VdCBH1催化残基位点突变前后的酶活变化。结果表明,VdCBH1基因编码区全长1 356 bp,编码451个氨基酸,蛋白理论分子量大小为48.574 kDa,理论等电点为4.29,N端前17个氨基酸为信号肽序列。保守结构域和进化树分析表明,VdCBH1蛋白含有GH7_CBH_EG保守结构域,该结构域是糖基水解酶7家族(Glycosyl hydrolase family 7,GH7)所特有的,与尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)的外切葡聚糖酶蛋白亲缘关系最近。重组VdCBH1蛋白具有典型的外切葡聚糖酶活性,而Glu233催化残基单突变与Glu228、Asp230和Glu233催化残基三突变蛋白的酶活明显下降。这表明催化残基Glu233在外切葡聚糖酶活性中发挥更为重要的作用,Glu228、Asp230则可能在其中起协同作用。本研究为进一步揭示VdCBH1蛋白的催化机制奠定了理论基础。     

里氏木霉木聚糖酶XYN Ⅱ基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN Ⅱ)的cDNA序列.测序结果表明,XYN Ⅱ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp,编码223个氨基酸,N端1～19个氨基酸为潜在的信号肤序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xyn Ⅱ)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1.45IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0.     

Expression,purification and activity detemination of recombinant human keratinocyte growth factor in Pichia pastoris

AIM:To determine the conditions of recombinant human keratinocyte growth factor(hKGF) expression for large-scale production using Pichia pastoris(P.pastoris). METHODS:The DNA fragment encoding hKGF mature peptide was artificial synthesized. This artificial gene, which consisted of 20 codons of preference in P. pastoris, was cloned into secretory expression vector pPICZαA and transformed into P. pastoris X-33 strain. Under the optimal conditions in a 5 L fermentor, the target protein was purified using the combination of ultrafiltration and chromatography. The pro-proliferative activity of this protein for rhesus monkey lung epitelial cell line 4MBr-5 was detected by MTT assay. RESULTS:After 60 h of fermentation induced by methanol at 20℃, the expression level of recombinant hKGF was up to 14.1% of the total supernatant proteins. Subsequent filtration through heparin affinity chromatography and Sephadex G-25 yielded 12 mg/L target protein with purity > 95.0%. The glycosylated hKGF stimulated the proliferation of 4MBr-5 cells in vitro and its ED₅₀ was 57μg/L. CONCLUSION:The glycosylated hKGF was successfully expressed using P. pastoris and was able to improve the proliferation of 4MBr-5 cells in vitro.     

鸡骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性测定

为了在毕赤酵母中表达鸡骨保护素(chOPG),采用DNA重组技术将鸡OPG成熟肽cDNA片段插入毕赤酵母表达载体pPICZ帷糃D·2 A中,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选阳性重组子,经甲醇诱导,实现了OPG在毕赤酵母中的分泌表达.SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达产物存在两种形式,其相对分子质量分别为43 000和53 000,表达量约为200 mg·L-1,经免疫印迹验证,有较好的抗原性.表达产物经处理后加入到体外培养的鸡胚破骨细胞上,能显著抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,减少骨吸收陷窝的个数与面积.     

外源基因在原核生物和真核生物中的表达(英文)

[目的]研究外源基因在原核生物和真核生物中的表达。[方法]将带有目的基因的表达载体pTYB2-WF转化大肠杆菌ER2566,用IPTG诱导植酸酶基因表达。用SDS-PAGE验证植酸酶融合蛋白表达情况,并进一步对融合蛋白进行纯化。用毕赤酵母表达系统表达植酸酶基因phyA;构建酵母整合载体pPIC9K-phyA,转化毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结果]在甲醇的诱导下表达植酸酶,经酶活力的测定,其植酸酶活力达7.3μ/ml,构建了毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结论]甲醇酵母表达机制在分子生物学以及工业应用领域发挥作用。     

Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达与性质测定

碱性蛋白酶作为广泛应用的蛋白酶之一,具有重要的工业应用价值。发掘优质的碱性蛋白酶基因,实现其高效表达,有助于更好的满足工业应用需求。分别将Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶基因pa1及pa2与表达载体pPIC9连接,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对于纯化后的重组蛋白PA1及PA2的酶学性质进行测定,二者最适pH均为8.5,最适温度均为60 ℃,与同类酶相比具有一定的优势;PA1及PA2的温度稳定性较好,50 ℃下酶活保持稳定,60 ℃下处理10 min,二者均保持70%左右的酶活;PA1及PA2的pH耐受范围宽泛,在pH 4.0~11.0的环境中处理1 h,均能保持80%以上的活性。此外,PA1及PA2对于表面活性剂和还原剂也表现出一定的耐受性。这些性质都表明PA1及PA2是具有工业应用潜力的优质碱性蛋白酶。     

HarpinXooc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性检测

采用PCR方法从水稻细菌性条斑病菌RS105菌株中扩增harpinXooc编码基因hrf2,将其克隆到酵母表达载体pPICZαA的分泌信号肽基因下游,获得重组表达质粒pPICZαA-hrf2。重组表达质粒线性化后电击转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵上清液经浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析,在约18kD处有特异目标条带出现。Western blot检测表明表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明酵母重组表达蛋白harpinXooc能够诱导烟草产生过敏反应和促进烟草生长,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinXooc。