Rapid Generation of Selectable Marker-Free Transgenic Rice with Three Target Genes by Co-Transformation and Anther Culture

The ‘double T-DNA’ binary vector p13HSR which harbored two independent T-DNAs, containing hygromycin phosphotransferase gene (hpt) in one T-DNA region and three target genes (hLF, SB401, RZ10) in another T-DNA region, was used to generate selectable marker-free transgenic rice by Agrobacterium-mediated transformation. The regenerated plants with both the three target genes and the selectable marker gene hpt were selected for anther culture. RT-PCR analysis indicated that target genes were inserted in rice genomic DNA and successfully transcribed. It took only one year to obtain double haploid selectable marker-free transgenic plants containing the three target genes with co-transformation followed by anther culture technique, and the efficiency was 12.2%. It was also noted that one or two target genes derived from the binary vector were lost in some transgenic rice plants.     

Introduction of T-DNA into Watermelon by Stigma Smeared Method and Its Molecular Marker Research

[Objective]The aim was to introduce T-DNA into watermelon for its molecular marker research.[Method]Based on the method of foreign DNA introduced to Arabidopsis thaliana via dipping flowers,the stigma smear was used to transfer T-DNA into watermelon and its molecular marker research was carried out.[Result]The ideal transformed species was ZXG01078 for the highest fruit setting rate and the most deviant seedlings.The best concentration of kanamycin for treating watermelon seeds was 500-700 mg/L with differences among the species.The best position was spire leaf or young leaf and the best concentration of kanamycin for treating the watermelon leaf was 4 000-8 000 mg/L with no significant difference among species.The steadily variation appearing of growing pointless and conjoined twin seedlings indicated that the normal growth had been interfered by foreign DNA in the progeny.[Conclusion]This study had provided basis for the further research on watermelon.     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

水稻高效RNA干涉体系的建立及其在受体激酶基因功能研究中的应用

利用RNA干涉(RNAi)技术，可以特异性的抑制真核生物体中目标基因的表达。本研究构建了适合水稻转化的RNAi诱导载体pCADS1341。为检测其有效性，使用它构建了针对GUS基因的RNAi载体，并利用基因枪转化法导入GUS基因稳定表达的转基因水稻愈伤组织。GUS染色分析结果表明该载体中RNAi诱导元件的瞬时表达可显著抑制GUS基因的表达。为探讨影响水稻中转基因诱导的RNAi效率的因素，对针对某个目标水稻基因的水稻RNAi植株进行了详细的分析。通过Southern和Northern杂交检测了T0代RNAi植株中T-DNA插入的拷贝数和目标基因的表达量，筛选出T-DNA为单拷贝插入，且目标基因的表达被高效抑制的株系。对来源于该株系的T1代植株进行了半定量RT-PCR检测，结果表明RNAi效应可以遗传给后代转基因水稻植株，但是不同个体中的RNAi效率存在差异。RNAi系统的表达量可能是决定RNAi效率的最关键因素。我们建立的高效RNAi技术体系对于水稻功能基因组学研究具有重要意义，利用这个系统我们已经构建了60多个水稻受体激酶基因的RNAi载体，系统的研究正在进行中。     

粳稻中花11 T-DNA插入突变体的分离和鉴定

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,对中花11成熟胚愈伤组织进行T-DNA转化,构建了含1489个独立的再生转化株系的突变体库,不仅为水稻功能基因组提供了一个有效的研究平台,还创造了一些具有优良农艺性状的突变材料,为水稻育种提供新的基因资源。插入第1代单本移栽且单本收获,第2代播种1066个家系,在水稻各个生育阶段从中独立筛选得到各类外形突变体66个。经过第三代重复筛选获得包括茎、叶、花和穗变异等各类突变52份。结果表明,外观性状的突变频率为3.4%。     

插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系

 通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低     

根癌农杆菌转基因的分子机制

根癌农杆菌将T-DNA转移并插入寄主细胞的基因组,需要趋化与附着、vir区活化、T-DNA切割及转运、T-DNA整合及表达等步骤。本文对这些步骤分子机制的研究进展进行了综述。     

基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究

为了得到带有明确遗传标记的毒性突变菌株,应用基因枪转化技术,以小麦条锈菌野生白化菌系为转化受体,以含有潮霉素抗性基因(Hyg)的质粒为插入载体,对基因枪介导小麦条锈菌插入突变的条件进行了研究。结果表明,当小麦条锈菌夏孢子萌动2 h,可裂膜承载压力为1 100 Psi时进行轰击转化,所得的小麦条锈菌夏孢子在含有潮霉素的培养基上萌发率最高,为36.09%。进一步将转化的小麦条锈菌夏孢子进行扩繁,在筛选品种上筛选,将筛选到的突变体在其上继代培养4代,获得了两个稳定的毒性突变菌株MM-2、MM-3。MM-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;MM-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2、3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。进一步用Hyg基因特异PCR在两个突变菌系中均扩增到目的片段,表明MM-2、MM-3的突变是由Hyg基因插入引起的。     

无芒隐子草全基因组水平全长LTR反转录转座子鉴定及其中断基因分析

LTR反转录转座子是植物基因组内大量可移动的遗传因子,是基因组的重要成分之一。无芒隐子草基因组大小为543 M,全基因组中共鉴定出了299079个LTR反转录转座子,占全基因组的26.54%,但是缺少无芒隐子草全长LTR反转录转座子的研究。基于无芒隐子草全基因组序列,筛选出具有潜在活性的全长LTR反转录转座子845个,其中有410个属于Gypsy超家族,435个属于Copia超家族。对这些序列进行了系统进化树的构建和插入时间的分析,发现全长LTR反转录转座子的大量转座发生在4百万年内,插入时间较近,插入高峰期是1~1.5百万年间。筛选出被全长LTR反转录转座子中断的基因有183个,145个被中断的基因得到了GO功能注释,分析了被中断基因在不同干旱胁迫处理下的基因表达模式。对反转录转座子的鉴定有助于深入了解无芒隐子草的进化过程,为无芒隐子草全长LTR反转录转座子与中断基因的后续研究奠定基础。     

变迹加权三角形IDT结构的SAW滤波器设计与实现

利用改进的δ函数模型对变迹加权三角形的IDT结构进行建模仿真,根据仿真结果设计SAW带通滤波器版图,并在实验室制作了中心频率为200 MHz、带内插损为6 dB的SAW带通滤波器样品,结果表明其仿真结果与试验结果的一致性较好.