青海省西宁地区绵羊住肉孢子虫感染情况调查研究

为了掌握青海省西宁市及其辖属区县绵羊住肉孢子虫的感染强度并明确感染类型。通过随机采集供往西宁市辖属区县各市场、超市及摊贩的屠宰后绵羊不同部位肌肉组织,进行压片镜检、染色切片观察和形态学鉴定;选取虫体含量高的羊心肌和膈肌样品,提取基因组DNA以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(Cox1)基因设计引物进行PCR扩增并测序比对。西宁市辖属区县绵羊住肉孢子虫感染率为82.5%,平均感染强度7.67,从寄生部位上看,膈肌感染率最高(75%),其次是心肌(67.5%)、舌肌(57.5%),食道肌未见有感染。所检虫体边缘肌肉组织较疏松,虫体囊壁分为两层,原生囊壁与次生囊壁均结构平整无突起皱褶等特殊性结构,经PCR扩增出长度为905 bp的目标片段,测序后在GenBank上进行序列比对,其与已公布的羊柔嫩住肉孢子虫的同源性达98%,最终鉴定为羊柔嫩住肉孢子虫。初步明确青海西宁地区绵羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子虫(Sarcocystis tenella)为主,且西宁市感染率高于中国绵羊住肉孢子虫感染的平均水平。建议加强青海省西宁地区羊住肉孢子虫实验室检测及调运、屠宰检验检疫力度,保证上市羊肉类产品卫生质量,保障公众的身体健康和饮食安全。     

一株寄生于大黄鱼的盾纤毛虫分子鉴定与系统进化分析

在大黄鱼稚鱼上发现一种可侵入患鱼体表、肌肉、腹腔和脑的盾纤毛虫，为了进一步明确该盾纤毛虫的分类地位，提取患鱼样品总DNA，对该虫株SSU rDNA和线粒体cox1部分序列进行PCR扩增、测序，与GenBank中纤毛虫的SSU r DNA和线粒体cox1序列进行同源性分析并构建系统发育树。结果显示，该盾纤毛虫874 bp的SSU rDNA部分序列与显赫针口虫（Porpostoma notata）同源性最高，相似性为98.97%。在基于SSU r DNA构建系统发育树中与显赫针口虫（P.notata）聚为一支，并独立于嗜污科（Philasteridae）的分支；获得该虫1 086 bp的cox1部分序列，与其SSU rDNA序列相比表现出更大的遗传变异度，在基于cox1部分序列构建系统发育树中，该虫株与嗜污科（Philasteridae）、尾丝虫科（Uronematidae）的分支也有一定距离。综上，该盾纤毛虫应是嗜污目（Philasterida）、针口虫属（Porpostoma）的显赫针口虫（P.notata）或其近缘种。     

猪肠道组织RIG-I的表达及其在猪传染性胃肠炎病毒致病机制中作用的初步研究

为探究天然免疫分子维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)在猪肠道组织中的表达情况，评价其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)致病机制中的作用。本研究经原核表达重组RIG-I蛋白(rRIG-1)并采用SDS-PAGE切胶纯化该蛋白，将其免疫大白兔制备兔RIG-I多克隆抗体，采用间接ELISA检测抗体效价。结果显示获得了效价可达1∶64 000的兔RIG-I多克隆抗体。利用该抗体经western blot检测SPF猪各肠道组织中RIG-I的表达。结果显示，制备的多克隆抗体可与猪各肠道中的RIG-I反应，且RIG-I在SPF猪空肠中的表达量最高。利用该抗体经western blot检测TGEV感染的ST细胞及猪空肠中RIG-I的表达水平。结果显示，TGEV感染后ST细胞中RIG-I的表达水平极显著高于空白对照细胞(P<0.01)；与正常SPF猪空肠相比，TGEV感染的SPF猪空肠组织中RIG-I蛋白的表达水平明显提高。表明TGEV感染后能够刺激细胞内源性及感染猪肠道组织中RIG-I蛋白的表达水平。将本研究构建的重组质粒p CAGGS-RIG-I-flag和RIG-I干扰RNA (siRIG-I)分...     

氨基酸代谢变化引起的c-di-GMP稳态波动对大肠杆菌致病过程中菌毛合成的影响

[目的]细菌能够合成多种信号分子,调控自身在各种营养状态或应激条件下的生长代谢及毒力发挥。第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)在致病菌感应氨基酸饥饿(AAS)的过程中发挥重要作用,调控多种生理活动并显著影响其毒力发挥。本文旨在研究c-di-GMP在尿道致病性大肠杆菌(UPEC)尿道定殖及毒力发挥过程中的作用。[方法]采用尿液培养UPEC,结合转座子突变技术筛选氨基酸代谢相关生长缺陷基因,采用基因敲除技术、特定氨基酸回补及小鼠尿道感染模型验证尿液生长及尿道定殖缺陷表型;借助表达谱数据、RT-qPCR及β-半乳糖苷酶活性测定法筛选并鉴定受氨基酸饥饿影响的毒力基因及c-di-GMP相关基因;通过多基因敲除及回补技术、凝胶阻滞试验(EMSA)鉴定c-di-GMP对毒力基因的调控机制。[结果]精氨酸、异亮氨酸及蛋氨酸代谢失衡引起UPEC在尿液中生长缺陷,尿道定殖能力显著下降及局部c-di-GMP稳态破坏;YciR及YcgF相关c-di-GMP体系失衡显著下调菌毛基因簇表达;YciR通过调节子MlrA直接调控P菌毛基因簇表达;YcgF通过下游配对调节子YcgE直接调控P菌毛基因簇表达。[结论]c...     

健全人格培养目标下的中学校园景观设计方法与应用——以靖江中学校园景观设计项目为例

在深化教育改革的背景下，以健全人格培养为目标，分析了中学校园景观设计的研究现状，结合当代中学生的最新特征，提出了“P·E·S·S·I”健全人格培养型中学校园景观设计方法，并探索了一套设计策略。以靖江中学校园景观设计项目为例，对“P·E·S·S·I”景观设计方法进行了实践。一方面探索更有利于健全人格培养的中学校园景观设计方法，另一方面为今后其他中学校园景观设计提供一种设计思路。     

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因（ifi44）在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸［Poly（I:C）］刺激过程中的表达模式，为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框（ORF），通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析，根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况，并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后的时序表达情况。【结果】 On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp，编码478个氨基酸残基，其编码蛋白分子量为52.7 kD，理论等电点（pI）为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域（1~157 aa）和1个GTP-bd结构域（197~322 aa），不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%；基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支，二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达，且主要在T细胞亚群表达；经无乳链球菌感染和Poly （I:C）刺激后，On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化，且存在明显的时间依赖性。【结论】 On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域，进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能； On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后呈时间依赖性上调表达，表明ifi44基因作为重要的调节因子，参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。     

脑心肌炎病毒VP3蛋白抑制I型干扰素信号通路促进病毒体外增殖的研究

天然免疫是抵抗病原微生物感染的第一道防线，为探究病毒蛋白在脑心肌炎病毒感染引起的天然免疫应答过程中的作用机制以及对病毒体外复制的影响，本研究应用分子生物学技术构建结构蛋白VP3的表达载体p CMV-Myc-VP3，转染HEK293细胞后，使其在细胞内过表达；感染病毒后，通过实时荧光定量PCR和TCID50分别检测病毒的基因组拷贝数和病毒滴度，以此验证VP3蛋白表达对EMCV体外增殖的影响；另通过荧光定量PCR检测VP3过表达对EMCV引起的IFN-β和信号通路相关因子m RNA转录水平的影响。结果表明，VP3蛋白可促进EMCV在HEK293细胞内的增殖，初步探索发现VP3蛋白可显著抑制IFN-β的表达。WesternBlot检测发现体外表达VP3后，MAVS蛋白的表达明显减少，但对MDA5表达无影响。试验数据初步表明，VP3蛋白可以通过抑制MAVS的表达拮抗I型IFN信号通路的活化，进而促进病毒增殖。     

藻类响应缺铁胁迫的光合机制研究进展

为了深入了解缺铁胁迫对藻类光合作用的影响,本文归纳了铁在光合电子传递链中的重要作用,总结了铁缺乏对藻类光合原件的破坏作用以及藻类的光合响应机制。围绕光合电子传递链,对容易受到铁缺乏影响的叶绿素、光系统、捕光天线等光合元件进行了归纳总结。研究得出,缺铁胁迫严重破坏藻类叶绿素的生物合成,影响光系统I(PSI)、光系统II(PSII)及其外周捕光天线的含量、活性和蛋白稳定性。藻类通过在光系统周围产生新的铁诱导蛋白或功能替代蛋白,调整光系统与捕光天线之间的结构与功能,应对缺铁胁迫。     

非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体，根据HLJ/2018株的I177L序列，设计引物，扩增带有His标签序列的I177L序列，并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中，转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达和切胶纯化后，用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。结果显示，在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下，诱导5 h后，重组MBP-I177L蛋白表达量最高，蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符；重组蛋白以可溶性表达为主；多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示，抗体效价为1∶128 000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。     

dsRNA和Aza-CdR转染猪肾细胞的全基因组差异甲基化区域分布特征的比较

本研究旨在通过比对PolyI：C和Aza-CdR转染猪肾细胞后全基因组差异甲基化峰的分布特征，进而筛选Gene Ontology （GO）特有的差异甲基化基因，分析差异甲基化区域。首先，基于MeDIP-chip技术，采用猪385 K全基因组启动子和CpG岛甲基化芯片，分析3组试验材料（病毒模拟物Poly I：C转染的猪PK15细胞、甲基化酶抑制剂Aza-CdR转染的PK15细胞、无处理的mock细胞），通过Peak DM Value和Peak Score值获得试验组间显著性富集的差异甲基化峰；其次，对差异甲基化基因进行GO注释，筛选差异甲基化区域和差异甲基化基因。最终结合Bisulfite克隆测序和mRNA荧光定量表达试验验证差异甲基化区域DMR。试验初步揭示猪肾细胞全基因组DNA甲基化主要分布于5'调控区域。试验在组间比较后，特别是在P vs.C和A vs.C比较中发现DNA甲基化在基因组上的分布特征与CpG岛密度与距离TSS的位置有关，而在近启动子区域（0―+200 bp） DNA甲基化显著影响基因的表达。Poly I：C对PK15作用使得TSS附近200 bp （-200―+500 bp）低甲基化启动子增多，说明Poly I：C与Aza-CdR的作用相似，均具有潜在的去甲基化作用，特别是位于猪14号染色体上BNIP3L基因的10459946―10460615 bp区段共有669 bp Peak Length CG位点发生去甲基化。研究揭示，PolyI：C和Aza-CdR并不是对猪所有基因具有去甲基化作用，主要针对特有基因的特有启动子，证明这些特有启动子的CpG岛对Poly I：C和Aza-CdR具有特别的敏感性。