基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。     

魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

中国明对虾MKK4基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达分析

为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为FcMKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现FcMKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,FcMKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达谱式,表明FcMKK4可能参与中国明对虾非生物胁迫的应答反应。     

一株引起坛紫菜绿斑病病原的分离鉴定及致病性研究

为了明确引起坛紫菜绿斑病的病原,对2012年发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿斑病开展了病原的分离鉴定和致病性研究。利用2216E海水培养基平板,从患病藻体分离得到一株优势细菌X5;在实验室条件下将X5进行回接感染实验,在显微镜下观察到坛紫菜叶状体发生组织病理变化,出现绿斑病症状:感染初期出现黄绿色小斑点,病斑逐渐扩大出现空洞,最后导致紫菜叶片流失;用浓度为10⁴~10⁸ cfu/mL的X5感染坛紫菜时,在7 d内引起紫菜出现10%~100%病斑面积,这些结果表明X5为坛紫菜绿斑病的病原。利用生理生化和多基因序列分析方法对X5进行鉴定,结果显示该菌为革兰氏阴性菌,大小为0.6 μm×0.4 μm~1.0 μm×0.4 μm,无鞭毛,在温度4~42℃、盐度50~150、pH6~10范围内生长,最适生长温度为16℃,最适生长盐度为50,最适pH为7,对甲硝唑、林可霉素和青霉素耐药,对25种抗生素敏感,Biolog和API ID-32E细菌鉴定系统的结果显示X5为弧菌属细菌(Vibriosp.);基于多基因序列(16S rRNA,rpoA,recA,pyrH)构建的系统进化树分析显示,X5与V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis聚为一支,进化距离为0.095~0.108,这些结果说明X5为弧菌属的一个新种或是V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis之一的一个新亚种。本研究报道了弧菌X5能够引起坛紫菜绿斑病,为紫菜流行病学及疾病防治提供了理论支撑。     

桑沟湾水域叶绿素a在海带收获前后的变化及其影响因素

依据2014年5月和8月2个航次走航和定点连续调查资料,分析了桑沟湾水域叶绿素a的空间分布及海带养殖区叶绿素a(Chl.a)的昼夜变化特征,同时结合所调查的温度、盐度 、pH和营养盐等分布特征,分析了桑沟湾水域Chl.a浓度与理化因子的关系,探讨了海带收获前后Chl.a的变化及其影响因素。(1)走航调查的结果显示,桑沟湾夏季Chl.a浓度显著高于春季。桑沟湾春季表、底层总Chl.a浓度均值分别为(0.67±0.39)和(0.50±0.31)μg/L,表层Chl.a浓度高于底层,春季表层整体表现出自湾内向湾外逐渐降低的趋势;夏季表、底层总Chl.a浓度均值分别为(3.39±1.53)和(3.12±1.43)μg/L,表层Chl.a浓度高于底层。桑沟湾夏季表层Chl.a高值区出现在海带养殖区,低值区出现在贝类养殖区,夏季底层Chl.a高值区出现在贝类和海带养殖区,低值区出现在外海区。(2)定点连续监测结果显示,春季海带养殖区Chl.a浓度变化范围在0.24~0.95 μg/L,均值为(0.70±0.19)μg/L,昼夜波动较小。而夏季海带养殖区Chl.a浓度变化范围在2.01~4.66 μg/L,均值为(3.04±0.82)μg/L,昼夜波动较大。桑沟湾海带养殖区夏季Chl.a浓度显著高于春季。春季海带养殖区营养盐平均浓度及硅磷比、氮磷、硅氮比均显著低于夏季。(3)桑沟湾春季表层Chl.a浓度主要与温度、硅酸盐呈显著正相关,而夏季底层Chl.a浓度与盐度呈显著正相关。桑沟湾海带收获前后Chl.a的变化及分布受温度、硅酸盐、盐度、养殖环境状况和水文环境的共同影响,多元的贝藻养殖模式是影响Chl.a变化及分布的重要因素。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成.本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式.结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低.鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达.鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达.其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调.用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达.研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程.本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制.     

聚β-羟基丁酸酯对凡纳滨对虾抗WSSV 能力及免疫基因表达量的影响

本实验采用单因子浓度梯度法,以添加不同质量分数(0.0%,0.5%,1.0%,2.5%,5.0%,10.0%)聚β-羟基丁酸酯(PHB)的人工配合饲料饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)20 d后,对其进行白斑综合症病毒(WSSV)感染测试;利用实时荧光定量PCR技术分析PHB对凡纳滨对虾抵御WSSV侵染能力的影响,并选择最高免疫保护率(RPS)组进行不同时间点基因表达量分析。研究发现,PHB对感染WSSV对虾的存活率无显著影响(P0.05);但感染WSSV的对虾平均存活时间随PHB浓度上升呈现先上升后下降再上升的趋势,饲喂PHB对虾的平均存活时间均高于对照组,其中1.0%PHB浓度组对虾平均存活时间最长,且显著高于空白对照组及5.0%PHB浓度组(P0.05)。分析各组对虾体内病毒含量,发现1.0%PHB浓度组对虾病毒含量在实验前期显著低于对照组(P0.05)。对虾感染WSSV后,对对照组及1.0%PHB实验组对虾前48 h内6个采样时间点的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、溶菌酶(lzm)及抗菌肽(abp)5个基因进行表达趋势分析,结果表明基因表达趋势在两组间无显著区别;投喂PHB的对虾在感染WSSV后血淋巴中sod、cat、gsh-px和lzm表达量呈现上升后下降再上升的趋势且分别在6 h、6 h、3 h、6 h达到最大值;abp在WSSV感染3 h内急速下降,随后在12 h达到最大值后又下降;另外饲喂PHB对虾体内免疫基因表达量均高于对照组。结果说明,PHB能够提高凡纳滨对虾对WSSV的抵抗力,且在一定程度上提高了对虾的免疫力。     

大菱鲆选育家系抗鳗弧菌性能

基于家系选育技术开展了大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌病选育研究, 从2010年构建的37个选育二代家系中选择成活率高的30个家系进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染实验, 开展对鳗弧菌的抗病性研究。结果表明, 不同家系间抗鳗弧菌感染能力存在着显著差异(P＜0.05); 30个家系中, 鳗弧菌感染后, 12个家系的存活率达到65% 以上, 其余家系的存活率则低于65%; 通过bCOX回归分析, 计算各家系的优势比, 优势比最高的5个家系的存活率达到65% 以上; 对各家系的成活率、优势比和死亡历时差4项指标进行聚类分析, 优势比最高且存活率达到65% 以上的5个家系聚为一类。综合感染家系的高成活率、高优势比以及聚类分析的结果, 选育出5个抗病力较强的优良家系。选育出的抗病力较强的家系可做为抗鳗弧菌选育的核心育种群体, 为抗鳗弧菌病的传代选育奠定良好的基础。

     

绿原酸诱导凡纳滨对虾抗氧化功能及抵御低盐度胁迫的响应

选择健康、均匀, 体质量为(6.74 ± 0.08) g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),  将360尾随机分为4组, 分别投喂含有0 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg绿原酸的饲料28 d, 随后将对虾从盐度为32的天然海水直接转移至盐度为10的海水中暴露72 h, 测定对虾肝胰腺TAS、GPx、CAT活力和GPx、CAT基因表达水平。结果显示, 在天然海水养殖条件下, 绿原酸对凡纳滨对虾肝胰腺TAS、GPx活性无明显影响, 但投喂含有绿原酸的饲料28 d, 对虾肝胰腺GPx、CAT和GPx、CAT基因表达水平显著高于D0组(P<0.05), 以D2组GPx活性和GPx、CAT基因表达水平最高, 分别为164.29 U/mgprot和1.61、2.14倍。低盐度胁迫24 h, D0组对虾抗氧化反应表现在TAS、GPx活性和GPx基因表达水平较28 d显著升高(P<0.05), 分别增加了31.30%、27.96%和170%, 而绿原酸各组对虾肝胰腺TAS、GPx活性和GPx基因表达水平显著低于D0组(P<0.05), 说明绿原酸可有效缓解低盐度胁迫下对虾抗氧化系统酶活性的剧烈波动。低盐度胁迫72 h, 绿原酸各组对虾肝胰腺TAS、GPx、CAT活性及CAT基因表达水平均明显高于D0组。上述结果表明绿原酸能够诱导凡纳滨对虾的抗氧化系统功能, 在凡纳滨对虾抵抗低盐度胁迫中发挥着重要的作用。本研究旨为开发绿色植物提取物在对虾养殖中的应用, 解决盐度胁迫对机体造成的氧化损伤提供理论依据。