基于GFM和GAMM模型分析对虾白斑综合征(WSSV)对黄海和东海北部水域虾类生物量的影响

虾类是海洋生态系统功能群的重要组成部分,其生物量变化受到多重因素的影响。本研究在开展黄海和东海北部水域虾类白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)流行病学调查的基础上,利用梯度随机森林模型(gradient random forest model, GFM)和广义加性混合模型(generalized additive mixed models, GAMM),分析了2016—2018年间黄海和东海北部水域WSSV流行对虾类生物量的影响。分子检测结果显示,调查所获取的26种虾类中,11种被检测为WSSV阳性;2016、2017和2018年WSSV阳性采样站点的比率分别为48.40%、38.75%和21.74%,虾类样品中WSSV阳性检出比率分别为16.86%、9.60%和4.80%。GFM模型分析显示,解释变量“阳性样品数的对数(ln_posi)”对响应变量“虾类生物量的对数(ln_Abu)”的重要性最高。GAMM分析中,根据赤池信息准则(Akaike information criterion, AIC)最小原则筛选出的最优模型为：ln_Abu~WSSV阳性率(P_rate)+ln_posi+经度(Long),该模型中ln_posi和P_rate是影响虾类生物量的极显著相关因子,ln_Abu随着P_rate的升高而降低。研究表明,WSSV在黄海和东海北部水域虾类中流行,推测对该海域的虾类生物量存在影响。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

用于水生病原菌的3种高通量活菌计数方法的比较

以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为研究对象,比较了MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数,确定了上述3种方法在副溶血弧菌活菌计数的标准曲线和线性范围。结果显示,副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT产物甲瓒在555 nm的吸光度(OD555 nm)为计数依据,活菌数的对数(LgC)与LgOD555 nm线性关系的标准曲线为LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125),相关系数R²=0.9965,线性检测范围为7.8×106~2.5×108 CFU/ml;ATP生物发光法以ATP产生的相对发光度值(RLU)为计数依据,LgC与LgRUL线性关系的标准曲线为LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366),相关系数R²=0.9994,线性检测范围为1.0×104~3.0×108 CFU/ml;高通量生长曲线法以生长曲线达到拐点的时间(Ts)为计数依据,LgC与Ts线性关系的标准曲线为LgC=?(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572),相关系数R²=0.9924,线性检测范围为1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3种方法对实际菌液测量并与平板计数法比较表明,ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性,MTT比色法准确度稍差,而高通量生长曲线法有最宽的线性范围,也最适合高通量测定。     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10 d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,病鱼外观无明显异常,但反应迟钝,伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现,各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 µm的肿大细胞。超薄组织切片中发现,肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150 nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物,从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus, RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)基因1362 bp的全长编码区,构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树,结果显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征,揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主,为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。     

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

杀鱼假交替单胞菌2515的抗弧菌效果及在对虾养殖中的应用

为探讨一株杀鱼假交替单胞菌 2515 Pseudoalteromonas piscicida (简称菌株 2515)在对虾养殖中的抗弧菌效果, 以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)为指示菌, 以鳗弧菌的敏感抗生素新霉素为参比, 采用牛津杯打孔法, 比较了菌株 2515 与抗生素抗菌等效关系。设置浓度分别为 10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 与鳗弧菌共培养, 评价了该菌对鳗弧菌的拮抗效果。将含量 10³ CFU/g、10⁵ CFU/g、10⁷ CFU/g, 及 10³ CFU/mL、 10⁵ CFU/mL、10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 分别添加到对虾饲料和养殖水体中, 养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei), 分析了菌株 2515 对水体和对虾肠道细菌总数、弧菌数及对抗副溶血弧菌效果的影响。结果显示, 相同抗鳗弧菌效果条件下菌株 2515 数量与新霉素质量存在对应关系, 与鳗弧菌混合培养时, 浓度 10⁶ CFU/mL 及 10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 对鳗弧菌表现出强的抑菌作用。饲料中添加菌株 2515 浓度 10⁵ CFU/g 及 10⁷ CFU/g 时能够显著降低对虾肠道中的弧菌数量(P < 0.05), 提高对虾养殖的存活率。采用副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)攻毒, 显示在饲料中添加菌株 2515 浓度为 10⁵ CFU/g 一组对虾死亡率最低, 为(43.3±5.8)%, 对副溶血弧菌的相对保护率达(53.7±6.2)%。结果表明, 在饲料和养殖水体中添加适宜浓度的菌株 2515 均能够提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌的能力, 降低对虾肠道内的弧菌数量。本研究结果为对虾养殖弧菌病生物防控提供了一种技术支撑。     

江苏高邮罗氏沼虾池塘养殖可培养微生物组成调查

为了探明罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)池塘养殖环境中重要微生物的组成, 以提升健康养殖管理技术, 分别于 2019 年 7 月、8 月和 10 月, 在江苏高邮市罗氏沼虾主养区开展了罗氏沼虾池塘养殖系统可培养环境微生物的组成调查。采用 LB 培养基分离纯化了罗氏沼虾肝胰腺、肠道、鳃及养殖水体中可培养的细菌, 利用细菌 16S rRNA 基因分子鉴定技术对分离菌株进行初步鉴定; 采用高通量测序技术分析了“铁壳”虾(养殖期生长缓慢)及铜绿微囊藻暴发池塘水环境微生物群落组成。以达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)为受试病原菌, 分析了池塘养殖系统中潜在病原拮抗菌的种类及效果。3 次调查共分离可培养细菌 605 株, 成功鉴定 601 株, 分别属于 37 个属 119 种, 其中罗氏沼虾体内分离到菌株 23 属 76 种, 养殖水体中分离到 28 属 81 种。确定了池塘养殖系统中存在气单胞菌(Aeromonas spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)等属的潜在病原菌。发生“铁壳”虾症的虾池优势环境微生物种类组成及占比与健康虾池相近, 但微小杆菌属(Exiguobacterium)与不动杆菌属(Acinetobacter)细菌占比高于健康虾池。铜绿微囊藻暴发影响环境微生物的组成结构, 嗜水气单胞菌属细菌占比增大。从池塘养殖系统筛选到甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、贝莱斯芽孢杆菌 (B. velezensis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)等潜在益生菌对气单胞菌具有较强拮抗作用。调查结果可为掌握罗氏沼虾池塘养殖系统细菌性病原组成及建立防控技术提供理论依据。     

克氏原螯虾病原菌感染发病标志性免疫及生理生化指标的筛选

为筛选克氏原螯虾(Procambarus clarkia)因受病原菌感染导致发病的标志性生理生化指标, 以嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)为攻毒菌株, 采用半致死剂量注射感染克氏原螯虾, 分析了感染初期(12 h)、发病期(24~72 h)和感染后恢复期(90 h)血淋巴中的非特异免疫、糖类代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及常规生理生化指标共 23 项, 结果显示, 在发病期, 8 项非特异免疫指标中, 感染组过氧化氢酶(CAT)活力和总抗氧化能力(T-AOC)在发病状态下提高显著(P＜0.01), 均值分别是空白对照组的 3.29 倍和 2.56 倍; 感染组发病期蛋白代谢指标白蛋白(ALB)和尿素(UREA) 浓度极显著提高(P＜0.01), 其浓度均值比空白对照组分别提高了 1.75 与 5.58 倍; 感染组发病期消化酶指标中淀粉酶(AMY)活力在发病过程中活性显著下降(P＜0.01), 比空白对照组下降了 74.18%; 血清中肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 4 种酶活力在发病期显著提高(P＜0.01), 与空白对照组比分别提高了 16.72、219.21、74.43、2.66 倍。在所检测指标中, 葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)和脂肪酶(LPS) 4 项指标在克氏原螯虾发病过程中均变化不显著(P＞0.05)。结果表明, 克氏原螯虾血清中 CAT、T-AOC、 ALB、UREA、AMY、CK、ALT、AST 及 GSH-Px 9 项指标变化对细菌感染发病极敏感, 可作为判断其受细菌病感染发病的标志性指标。本研究结果可为克氏原螯虾患病风险评估和疾病预警提供新的技术依据。     

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析,结果显示,12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing, ST)分型互不相同,7株为PubMLST数据库已经收录的ST型,5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因,但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征,对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点;不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异,对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。